Name: preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill at JoVE.com

Forskning i Gunjan labbet stöds av finansiering från National Institutes of Health, National Science Foundation och Florida Department of Health. Vi tackar grundutbildningsstudenten John Parker för teknisk hjälp.

1. Beredning av jäst Popcorn
<ol><li>Odla jästceller i 0,5 L av YPD-media till en densitet på 1 x 107 celler/mL. Räkna celler med hjälp av en Coulter Counter eller något annat sätt.</li>
	<li>Centrifugeringsceller i 10 min vid 2 400 g och 4 °C.</li>
	<li>Tvätta varje prov en gång med 500 mL iskallt avjoniserat 18 mega Ohm Milli-Q vatten.</li>
	<li>Resuspend pellets i 15 mL av iskall Lys Buffert [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycerol, med nytillsats reduktionsmedel 10 mM β-me...

<ol>
	<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Dunn, B., Wobbe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+protein+extracts+from+yeast.">Preparation of protein extracts from yeast.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast.">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li><li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins.">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li><li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification.">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li><li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization.">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+yeast+mitochondrial+DNA+in+high+yield.">Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).</li><li>Bzducha-Wr&#243;bel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+&#946;-glucan+isolation.">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for &#946;-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li><li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+the+sampling+of+dental+DNA.">A systematic approach to the sampling of dental DNA.</a> Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).</li><li>Sweet, D., Hildebrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+human+teeth+by+cryogenic+grinding.">Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding.</a> Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+(P.+taeda+L.)+and+other+conifer+species.">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).</li><li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li><li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis.">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li><li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway.">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li><li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).</li><li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae.">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li><li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis.">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li><li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments:+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols.">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li><li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria.">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).</li><li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata.">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).</li><li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li><li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation.">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food &amp; Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li><li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS/MS+determination+in+animal+tissue.">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li><li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation.">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li><li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+method+for+the+determination+of+copper,+manganese+and+iron+in+seafood+samples.">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li><li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium.">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li><li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sr-87/Sr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley:+Implications+for+early+hominid+habitat+preference.">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li><li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka.">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li></ol>

En begränsning av att studera inhemska proteiner från jäst är ineffektiva lys av jästceller på grund av deras tuffa cellvägg. Även om flera metoder har utvecklats, är den mest konsekventa och effektiva metoden i våra händer kryogrindningen av jästceller flashfryst som popcorn. Denna metod möjliggör tillförlitlig beredning av högkvalitativa hela cellextrakt från knoppande jäst jämfört med andra lysmetoder. De representativa resultaten visade att kryogrindningen är överlägsen en populär mekanisk met...

Jäst är en populär modell organism för protein studier, eftersom det är en enkel eukaryota organism med ett överflöd av genetiska och biokemiska verktyg som finns för forskare1. På grund av deras robusta cellvägg, en utmaning som forskarna står inför är att effektivt lysa cellerna utan att skada det cellulära innehållet. Olika metoder finns för att erhålla proteinextrakt genom störningar av jästceller som inkluderar enzymatisk lys (zymolyas)2,3, kemisk lys4, fysisk lys genom frys-tö5, tryckbaserad (fransk press)6,7, mekaniska (glaspärlor, grind coffeeer)8,9, ultraljudsbehandling-baserad10 och kryogen2,11. Effektiviteten av celllys och proteinavkastningen kan variera betydligt beroende på den använda tekniken, vilket påverkar slutresultatet eller lämpligheten för den önskade nedströmsapplikationen för lysate. När man studerar proteiner som är instabila, har flyktiga posttranslationella modifieringar, eller är temperaturkänsliga, är det särskilt viktigt att använda en metod som kommer att minimera provförlust eller nedbrytning under beredningen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Extrakt förberedelseteknik</td>
			<td>Detaljer</td>
			<td>Fördelar</td>
			<td>Nackdelar</td>
			<td>Analys nedströms</td>
			<td>Referens</td>
		</tr><tr><td>Fransk press: Högtrycks homogenisator (aka Microfluidizer) med enzymatisk förbehandling med hjälp av Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, en Microfluidizer högtrycks homogenisator. Disruptorn består av en luftdriven högtryckspump (förhållandet 1:250; erforderligt lufttryck 0,6-l MPa) och en särskild störningskammare med en extra backtrycksenhet. En minsta provstorlek på 20 mL krävs för bearbetning.</td>
			<td>Slutlig total störning som erhölls med hjälp av det kombinerade protokollet, att närma sig 100% med 4 passerar på en pressa av 95 MPa, som jämfört till endast 32% avbrott med 4 passerar på 95 MPa som använder endast homogenisering utan Zymolyasen.</td>
			<td>Inte lämpligt för småskaliga applikationer. Enzymerna kan bli dyra för storskaliga preparat.</td>
			<td>Protein rening</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Bead beater: Zymolyase behandlade celler lyst med glaspärlor i ett snabbprep instrument</td>
			<td>Ungefär en lika stor volym av kalla, torra, syratvättade 0,5 mm glaspärlor tillsätts till en given volym cellpellets i lysbuffert och cellerna störs av kraftig manuell agitation.</td>
			<td>Det är särskilt användbart när man gör extrakt från många olika små jäst kulturer för assaying ändamål snarare än för protein rening.</td>
			<td>Under glaspärla förfarandet, proteiner behandlas hårt orsakar omfattande skumning leder till protein denaturering. Mängden cellbrott varierar, medan proteolys samt modifiering av proteinerna kan bli följden av uppvärmning av extraktet över 4°C under den mekaniska brottningen.</td>
			<td>Mestadels DNA & RNA analyser, men också proteinanalys genom denaturering av gel elektroforesis, antingen med eller utan västerländsk blotting.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Zymolyasbehandling följt av lys med hjälp av en kombination av osmotisk chock och Dounce-homogenisering</td>
			<td>Efter enzymatisk matsmältning av cellväggar, spheroplasts lystnas med 15 till 20 slag av en åtsittande mortelstöt (clearance 1 till 3 μm) i en Dounce homogenisator.</td>
			<td>Fördelaktigt att använda proteas-bristfälliga stammar som BJ926 eller EJ101. Detta är det skonsammaste sättet att bryta jästceller och därmed är det mest lämpligt för att förbereda extrakt som kan utföra komplexa enzymatiska funktioner (t.ex. översättning, transkription, DNA-replikation) och där makromolekylära strukturers integritet (t.ex. ribosomer, skarvskulor) måste upprätthållas. Det är också användbart för att isolera intakta kärnor som kan användas för kromatinstudier (Bloom and Carbon, 1982) eller för kärnproteinextrakt (Lue och Kornberg, 1987).</td>
			<td>De stora nackdelarna med spheroplast lysproceduren är att det är relativt tråkiga och dyra, särskilt för storskaliga preparat (> 10 liter), och de långa inkubationsperioderna kan leda till proteolys eller proteinmodifiering.  För kromatinpreparat verkar de vara av varierande eller lägre kvalitet än de som produceras av differentialcentrifugeringen (baserat på nukleosom stegeintegritet).</td>
			<td>Isolera intakta kärnor för kromatinstudier, extrakt som kan utföra komplexa enzymatiska funktioner, extrakt som kräver integriteten hos makromolekylära strukturer, kärnproteinextrakt.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Cell Disruption of flash frozen cells by grinding in Liquid Nitrogen using a mortar/pestle or a blender</td>
			<td>Celler fryses omedelbart i flytande kväve och sedan lysts genom slipning manuellt i en mortel med hjälp av en mortelstöt, eller med hjälp av en Waring mixer i närvaro av flytande kväve.</td>
			<td>Protokollet är snabbt och enkelt. Det kan rymma varierande mängder jästceller inklusive mycket stora kulturer. Dess främsta fördel är att celler tas omedelbart från det aktivt växande tillståndet till flytande kväve (−196°C), minskande nedbrytande enzymaktiviteter som proteaser och nukleaser samt aktiviteter som modifierar proteiner (t.ex. fosfataser och kinaser). Det är särskilt lämpad för att göra hel-cell extrakt från en enda jäst kultur för storskalig protein rening.</td>
			<td>Lite rörigt och potentiellt farligt för den slarviga utredaren. Små prover (dvs. 10- till 100-ml jästkulturer) bearbetas inte lätt eftersom det inte finns tillräckligt med massa frysta cellklump för att bryta effektivt i mixern. Det är tidskrävande att bearbeta enskilda prover och att rengöra utrustningen mellan användningarna.</td>
			<td>Helcellsextrakt från en enda jästkultur för storskalig proteinrening.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolys, Pärlkvarn</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Snabb och effektiv lys, särskilt för småskalig extraktpreparering</td>
			<td>Värmegenerering leder till denaturering och nedbrytning av makromolekyler. Bead slå utrustning krävs.</td>
			<td>Småskaliga analyser.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolys, Ultraljudsbehandling</td>
			<td>pH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 varv/min, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, effekt 80%</td>
			<td>Ultraljudsbehandling utrustning är vanligtvis tillgänglig i de flesta institutioner.</td>
			<td>Värmegenerering leder till denaturering och nedbrytning av makromolekyler. Ultraljudsbehandling utrustning krävs. Långsam lys kan ta mer än 24 timmar.</td>
			<td>Jäst cell vägg preparat.</td>
		</tr><tr><td>Kokning och frys-tina-process</td>
			<td>Ingen specialutrustning behövs annat än en vanlig frys och ett värmeblock eller varmvattenbad.</td>
			<td>Effektiv, reproducerbar, enkel och billig.</td>
			<td>Värmegenerering leder till denaturering och nedbrytning av makromolekyler.</td>
			<td>DNA-analyser av PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Jämförelse av metoder som finns tillgängliga för beredning av jästextrakt.
Kryogrinding (aka kryogen slipning/kryogen fräsning) används vanligen för att hämta nukleinsyror, proteiner eller kemikalier från temperaturkänsliga prover på ett tillförlitligt sätt för kvantitativa eller kvalitativa analyser. Det har använts framgångsrikt för flera tillämpningar inom olika områden, inklusive bioteknik, toxikologi,forensisk vetenskap 12,13, miljövetenskap,växtbiologi 14 och livsmedelsvetenskap. Isolering av intakta biologiska makromolekyler är vanligtvis kritiskt beroende av temperaturen. Extremt låga temperaturer säkerställer att proteaserna och nukleaserna förblir inaktiva, vilket resulterar i en tillförlitlig isolering av intakta proteiner, nukleinsyror och andra makromolekyler för efterföljande analyser. En fryskvarn bibehåller i själva verket typiskt en provtemperatur på -196 °C (kokpunkten för LN2), vilket minimerar DNA/RNA eller proteindenaturering och nedbrytning.
Frysverket använder en elektromagnetisk slipkammare som snabbt flyttar en solid metallstång eller cylinder fram och tillbaka inom en injektionsflaska som innehåller provet som ska pulveriseras mellan rostfria ändpluggar. Instrumentet skapar och vänder snabbt ett magnetfält inom slipkammaren. När magnetfältet skiftar fram och tillbaka, krossar magneten provet mot pluggarna och uppnår på så sätt "kryogrinderingen" och pulveriseringen av popcornen. Frysverket ersätter mortel och mortel och tillåter sekventiell bearbetning av flera prover (eller upp till 4 mindre prover samtidigt) med hög reproducerbarhet och undviker variabiliteten för användaren i samband med manuell malning. När proverna har bearbetats kan cellextrakten användas för en mängd olika nedströmsapplikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL polycarbonate tubes with screw caps</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357002</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B38624</td>
			<td>High speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA-9.1000</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>366754</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Dextrose Anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>901521</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf A-4-44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22637461</td>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5150-1GA</td>
			<td>Volume excluder and cryoprotectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS6 antibody</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70796</td>
			<td>Antibody for HIS tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td>Salt for maintaining ionic strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>474790</td>
			<td>Proteasome Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P7170-1L</td>
			<td>Protein Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor JLA 25.500</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JLA 25.500</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>BX2165-1</td>
			<td>Histone Deacetylase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6521</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium &#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13408-09-8</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex Certiprep 6850 freezer mill</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>6850</td>
			<td>Freezer Mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>635502</td>
			<td>For pulling down HIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VW1521-07</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M131-250ML</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill

Den lätthet genetisk manipulation och den starka evolutionära bevarande av eukaryota cellulära maskiner i spirande jäst Saccharomyces cerevisiae har gjort det en framstående genetisk modell organism. Men eftersom effektiv proteinisolering beror på optimal störning av celler, hämmas användningen av jäst för biokemisk analys av cellulära proteiner av dess cellvägg som är dyr att smälta enzymatiskt (med hjälp av lyticase eller zymolyase), och svårt att störa mekaniskt (med hjälp av en traditionell pärlvisp, en fransk press eller en grind kaffebryggare) utan att orsaka uppvärmning av prover, vilket i sin tur orsakar protein denaturering och nedbrytning. Även om manuell malning av jästceller under flytande kväve (LN2) med hjälp av en mortel och mortelstöt undviker överhettning av prover, är det arbetsintensivt och föremål för variabilitet i celllys mellan operatörer. Under många år har vi framgångsrikt förbereda hög kvalitet jästextrakt med hjälp av cryogrinding av celler i en automatiserad frys kvarn. Temperaturen på -196 °C som uppnås vid användning av LN2 skyddar det biologiska materialet från nedbrytning genom proteaser och nukleaser, vilket möjliggör hämtning av intakta proteiner, nukleinsyror och andra makromolekyler. Här beskriver vi denna teknik i detalj för blivande jästceller som innebär att först frysa en suspension av celler i en lysbuffert genom sin dropwise tillägg till LN2 för att generera frysta droppar av celler som kallas "popcorn". Detta popcorn pulvriseras sedan under LN2 i en frys kvarn för att generera en fryst "pulveriserad" extrakt som tinas långsamt och förtydligas genom centrifugeringen för att avlägsna olösligt skräp. De resulterande extrakten är redo för nedströms applikationer, såsom protein eller nukleinsyra rening, proteomiska analyser, eller co-immunoprecipitation studier. Denna teknik är allmänt tillämplig för cell extrakt beredning från en mängd olika mikroorganismer, växt-och djurvävnader, marina exemplar inklusive koraller, samt isolera DNA / RNA från kriminaltekniska och permafrost fossila exemplar.

Vi jämförde två olika metoder för jästcellslys, nämligen glaspärla fräsning vid 4 °C och en automatiserad kryogrinderande metod vid -196 °C, för att bedöma de relativa återvinningsproteinerna i cellextrakten som utarbetats med båda metoderna. För denna studie valde vi att använda en spirande jäststam YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 redovi...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill at JoVE.com

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Vi beskriver en tillförlitlig metod för beredning av hela cellextrakt från jäst eller andra celler med hjälp av en kryogen frys kvarn som minimerar nedbrytning och denaturering av proteiner. Cellextrakten är lämpliga för rening av funktionella proteinkomplex, proteomiska analyser, co-immunoprecipitationsstudier och detektion av labila proteinmodifieringar.

Beredning av Cell Extrakt av Cryogrinding i en automatiserad Frys Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Jäst är populär modell organism, inte bara för genetiska studier utan också för biokemiska studier av proteiner och andra makromolekyler utvinns ur vild typ och mutant jäst stammar. Men på grund av deras tuffa cellväggar, en stor utmaning som forskare står inför är denna effektiva lys av jästceller utan att skada cellulära innehållet. Isoleringen av intakta biologiska makromolekyler är vanligtvis kritisk, beroende av temperatur.Förbereda extrakten vid låg temperatur säkerställer att de intracellulära proteaserna och nukleaserna förblir inaktiva, vilket resulterar i tillförlitlig isolering av intakt protein, nukleinsyror och andra makromolekyler för tillräcklig lys. Olika metoder finns för att erhålla jästextrakt genom enzymatisk, kemisk och fysisk lys. However enzymatisk lysning är dyrt tack vare kravet av renade enzym att smälta cellväggen, således att begränsa bruket av mindre numrerar av celler.Vidare måste de enzymatiska reaktionerna övervakas noggrant för att förhindra över matsmältning och för tidig lys av cellerna. Kemiska metoder med starka denatureringsmedel, men effektiva, resulterar i denaturering av proteiner och som sådan, är inte lämpliga för isolering av proteinkomplex eller funktionella enzymer. Fysiska metoder, såsom lys under högt tryck i en fransk Press kan utföras i kylan vid fyra Celsius men det är inte tillräckligt kallt för att förhindra nedbrytning och denaturering av alla inhemska proteiner.Andra populära fysiska metoder är användningen av en mortel och mortelstöt, mixer, eller kaffekvarn att mala jästceller resuspended i en lysis buffert och frysta som droppar eller slipning och blandning av glaspärlor och jäst i en snabb prep pärla visp kvarn eller en lysis av ultraljudsbehandling. Dock är manuell slipning arbetsintensiva och den resulterande protein avkastningen kan variera avsevärt beroende på de tekniker som används medan lys av ultraljudsbehandling eller slipning i en mixer, kaffekvarn, eller pärla visp kvarn genererar en betydande mängd värme, vilket resulterar i en protein denaturering och nedbrytning. Därför, för att erhålla jästcelllys med proteiner i sitt hemland med minimal denaturering och nedbrytning för tillämpningar som rening av funktionella proteinkomplex, biokemiska analyser eller detektion av flyktiga efter translationella modifieringar, är det viktigt att använda en lätt skalbar lysmetod som kommer att minimera värmegenereringen samtidigt som det möjliggör effektiv lys oberoende av mängden celler.Här beskriver vi en metod som innebär användning av en kryo frys kvarn för lys av celler i flytande kväve vid minus 196 Celsius för att generera frysta cellextrakt därigenom möjliggör återvinning av intakta funktionella makromolekyler, såsom proteiner eller DNA och RNA, vid en mycket låga temperaturer som minimerar denaturering och nedbrytning. Denna metod kan lätt anpassas för användning med alla typer av cell- eller vävnadsprov från alla arter, inklusive kriminaltekniska och till och med gamla prover som återvunnits från arkeologiska platser eller som finns frysta i permafrost. Frysverket använder en supraledande elektromagnetisk slipkammare som snabbt flyttar en solid metallstång fram och tillbaka i en fil av polykarbonat som innehåller provet som ska pulveriseras mellan slutproppar av rostfritt stål.Denna fysiska cell lysmetod möjliggör en mer effektiv lys och reproducerbara resulterar i en bättre kvalitet extrakt. Jästceller odlades vid en koncentration av 10 miljoner celler per mil. Dessa jästceller placerades pre kyld centrifugflaska och snurrades i 10 minuter vid 2, 400 G.Once snurran är klar, dekantera supernatanten utan att störa pelleterade celler.Denna pellet var resuspended i en liten mängd iskallt vatten, ungefär hälften av den ursprungliga volymen av kulturen för att tvätta cellerna. De återanvända cellerna snurrades igen ner i ytterligare 10 minuter vid 2, 400 G.Once nästa spinn är klar, vi, återigen, dekantera alla supernatant utan att störa pelleten. Denna pellet kommer sedan att återanvändas och 15 ML iskallt lys buffert.Se till att pelleten är helt återanvänds. De återanvända cellerna ska ligga kvar på is i ett förmärkt rör tills de är redo för nästa steg. Använd alltid personlig skyddsutrustning vid hantering av flytande kväve, som skyddsglasögon, handskydd och labbrockar.För att maximera vår fingerfärdighet bär vi ofta ett par vita termiska handskar inklämda mellan två par nitrilhandskar. Byt ytter- och nitrilhandskar ofta, eftersom de sliter lätt efter att ha utsatts för flytande kväve. I vårt labb överför vi en alikvot flytande kväve till en liten fem liter flytande kvävebehållare.Flytande kväve hälls sedan i ett 50 ML-rör som har förkylts på torris. När 50 ML röret är full av flytande kväve, lägger vi jästextrakt långsamt, i en droppe klokt sätt att röret i 1,5 milliliter steg. För att minimera bildandet av stora popcornpellets tillsätts jästupphängningen i en cirkelrörelse.För att ytterligare förhindra bildandet av stora popcornpellets använder vi stora tensor för att säkerställa att alla pellets är mellan 0,3 och 0,5 centimeter i diameter. Eftersom flytande kväve är alltid avdunstar, se till att fylla på röret med flytande kväve innan du lägger varje 1,5 mil alikvot av jäst suspension. När alla jäst suspension har gjorts till popcorn låta röret med popcorn att sitta utan lock i två till tre minuter för att låta alla kvarvarande flytande kväve att avdunsta.För att vara säker på att alla flytande kväve har avdunstat, stäng locket nästan helt och skaka försiktigt. Om det finns ett väsande ljud indikerar det att det flytande kvävet ännu inte helt har avdunstat. Öppna locket i ytterligare en minut eller så så att det återstående flytande kvävet avdunstar innan locket stängs tätt.Restvätska i röret kan orsaka explosion om locket stängs i förtid. Denna jäst popcorn kan lagras nästan på obestämd tid i minus 80 grader C.För minst fem prover, se till att du har 30 till 35 liter flytande kväve tillgängliga. Fyll frysverket till hela linjen och stäng locket så att frysverket kan förkyla i några minuter.Återigen, kom alltid ihåg att bära personlig skyddsutrustning när man hanterar flytande kväve. De polykarbonat slipning injektionsflaska, rostfritt stål änd pluggar, och slaganordning bar måste pre kyls med flytande kväve. Håll dessa komponenter nedsänkta tills det flytande kvävet slutar bubbla.Kom ihåg att hålla alla popcornprover på torris tills hela malningsprocessen är klar. Dra ut allt flytande kväve från slipningsflaskan och överför dina popcorn i injektionsflaskan. Glöm inte att placera en magnetisk slagor bar i slipning injektionsflaskan också.Täta slipflaskan genom att försiktigt placera den rostfria stålpluggen jämnt på slipflaskans ände. Vi bankar varje ände av slipflaskan på en träbrödbräda med en vibrationsabsorberande gummibak backing för att säkerställa att ändpluggarna placeras korrekt och tätar slipningsdillarna tätt. Det är viktigt att säkra ändpropparna för att säkerställa att de inte kommer loss och låter proverna spilla i frysverket under malningsprocessen.Placera en slipflaska i frysfräsens malkammare och lås på plats. Stäng frysfräslocket och slipa provet i tre cykler med två minuter per cykel, med en krossningsgrad på 14. Efter slipcyklerna är kompletta låsa upp injektionsflaskan med den frysta pulvercellen lysate.För att lysaten inte ska tinas upp ska du arbeta snabbt och försiktigt med att skruva loss en av ändpluggarna med hjälp av öppningsverktyget. När injektionsflaskan är öppen, ta bort provrörsstången och snabbt överföra det frysta pulverextraktet på en pre kyld plast vågskål. Återhämta så mycket av det frysta extraktet som möjligt genom att banka injektionsflaskan på träbrödbrädan.När allt pulver avlägsnas från injektionsflaskan, snabbt överföra alla av pulverextrakt i en pre-märkt 15 mil rör hålls på torris. Även om det är bäst att gå vidare med upptining och använda extrakten direkt för att minimera proteinnedbrytning, kan det frysta pulvret lysate lagras över natten på minus 80, om det behövs. Tina upp pulvret lysate långsamt i en isslam som kontinuerligt cirkuleras med hjälp av en magnetisk stigbar i en ishink.För att underlätta jämn upptining, ta bort is som utvecklas på utsidan av rören ofta, ungefär var femte minut eller så. När extrakten börjar tina vid 1X proteashämmare cocktail och 10 mikromolar proteasom hämmare MG132 för att förhindra proteinnedbrytning. När proverna är helt tinade, vilket kan ta över en timme, snurra ner proverna vid 3, 220 G i 20 minuter vid fyra Celsius grad.Denna snurra kommer att ta bort de flesta av cellen skräp från lysate. När snurrandet är färdigt överför supernatanten till polykarbonatflaskor som förkylts på is och kasta pelleten. Centrifugera supernaten och proverna vid 16, 000 G vid fyra Celsius grad i 20 minuter för att klargöra extraktet.Efter att snurrandet är klart, återvinn endast den klara supernatanten försiktigt från mitten av vätskepelaren utan att störa det grumliga lagret som innehåller biten på toppen eller det pelleterade skräpet längst ner på centrifugröret. Överför den klara lysate i en färsk pre kyld 15 Mil röret. Den återstående grumlig vätska kan vara recentrifuged i fem minuter med samma hastighet för att möjliggöra återvinning av några mer av grossist lysate.Extrakten är nu klara för användning i experiment, såsom rening av proteinkomplex och immunoprecipitation. Vi jämförde två olika metoder för jästcelllys, nämligen glaspärla fräsning vid fyra Celsius och en automatiserad kryoslipningsmetod vid minus 196 Celsius för att bedöma de relativa återvunna proteiner och cellextrakt som utarbetats med båda metoderna. Från denna studie valde vi att använda en spirande jäst stam bär en hög kopia plasmid uttrycka en tandem HIS-MYC taggade ubiquitin.Så vi kan bedöma affiniteten av återvinning av taggade polyubiquitinated proteiner från grossist extrakt, efter affinitet rening med hjälp av TALON kobolt HIS tag affinitet pärlor följt av västra blotting med en monoklonala HIS tag antikropp. Polyubiquitinerade proteiner som normalt är mycket kortlivade på grund av deras snabba nedbrytning av ubiquitin proteasome maskineriet och därmed erbjuda ett mycket bra sätt att jämföra kvaliteten på grossist extrakt som utarbetats av olika metoder. Som vi ser av den högra halvan av Ponceau färgade membran, vi återhämtade en högre total proteinutbyte i grossist extrakt som utarbetats av cryo frysverk protokollet som bedöms av de mer intensiva Ponceau färgning i hela grossist extrakt körfält.Detta är särskilt tydligt i de nedre och övre delarna av frysverket hela utdrag körfält. Dessutom, som framgår av den högra halvan av HIS tag Western blot, observerade vi en bättre återhämtning av HIS-MYC tag ubiquitinated protein följt av dra ner med hjälp av Talon pärlor från grossist extrakt som utarbetats av kryogen slipning. Vi dra slutsatsen att kryogena frysen kvarn är överlägsen andra metoder för beredning av cell extrakt, särskilt när funktionella makromolekyler krävs för nedströms ansökan.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Inkapsling av Droppar

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Upprättande och fraktionering av Xenopus laevis Egg Utdrag

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Använda Fraktionerade Xenopus Egg Utdrag

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskaliga nukleärextrakt för funktionella analyser av genuttryck maskinerier

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Jämförelse av tobak värdcell Protein borttagning metoder genom Blanche Intakta växter eller genom värmebehandling av extrakt

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Optimerad Scratch test för In Vitro tester av cellmigration med en automatiserad optisk kamera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Mätning av sammanflödet av iPSC med hjälp av ett automatiserat bildsystem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...