Name: infection of zebrafish larvae with aspergillus spores for analysis of host-pathogen interactions
Uploaded: 2020-05-16T14:30:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K22AI134677. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol>
	<li>Latge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+and+aspergillosis.">Aspergillus fumigatus and aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).</li><li>Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+aspergillosis.">Invasive aspergillosis.</a> Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).</li><li>Dagenais, T. R., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Aspergillus+fumigatus+in+Invasive+Aspergillosis.">Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).</li><li>Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+animal+models+of+aspergillosis+in+studying+immunity+against+Aspergillus+infections.">Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections.</a> Journal de Mycologie M&#233;dicale. 29 (1), 84-96 (2019).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).</li><li>Behnsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+dimensionality+controls+the+interaction+of+phagocytes+with+the+pathogenic+fungi+Aspergillus+fumigatus+and+Candida+albicans.">Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Infection:+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology.">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+as+a+Model+Host+for+Invasive+Fungal+Infections.">The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections.</a> Journal of Fungi. 4 (4), (2018).</li><li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo.">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System.">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).</li><li>Knox, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+phagocyte+responses+to+Aspergillus+fumigatus+conidia+and+hyphae+in+zebrafish+larvae.">Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae.</a> Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).</li><li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+inhibit+Aspergillus+fumigatus+germination+and+neutrophil-mediated+fungal+killing.">Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing.</a> PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).</li><li>Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+establishes+infection+in+zebrafish+by+germination+of+phagocytized+conidia,+while+Aspergillus+niger+relies+on+extracellular+germination.">Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).</li><li>Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-glucan-dependent+shuttling+of+conidia+from+neutrophils+to+macrophages+occurs+during+fungal+infection+establishment.">beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).</li><li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis-dependent+activation+of+a+TLR9-BTK-calcineurin-NFAT+pathway+co-ordinates+innate+immunity+to+Aspergillus+fumigatus.">Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).</li><li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+Orchestrates+Lateral+Transfer+of+Aspergillus+fumigatus+during+Macrophage+Cell+Death.">Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).</li><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenate+sensitivity+of+a+laeA+mutant+is+restored+by+overexpression+of+the+bZIP+protein+MetR+in+Aspergillus+fumigatus.">Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus.</a> Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro.">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).</li><li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+voriconazole+against+A.+fumigatus+infection+depends+on+host+immune+function.">Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).</li><li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+clinically+relevant+murine+model+of+solid-organ+transplant+aspergillosis.">A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis.</a> Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).</li><li>Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+immune+cell+clearance+of+Aspergillus+fumigatus+spores+and+hyphae.">Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae.</a> Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+the+Innate+Immune+Response+in+a+Zebrafish+Larval+Model+of+Streptococcus+iniae+Infection.">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zWEDGI:+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae.">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li><li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Live+Imaging+Device+for+Improved+Experimental+Manipulation+of+Zebrafish+Larvae.">Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).</li><li>Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Antifungal+Drug+Resistance.">Update on Antifungal Drug Resistance.</a> Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).</li></ol>

אין קונפליקטים או אינטרסים פיננסיים לחשוף.

מודל הזיהום המתואר כאן מועיל לניתוח התגובות החיסוניות המארחות, אינטראקציות מארח-פתוגן ופתוגנזהפטרייתית 12,13,14,15. מידע זה יכול להיגזר מהדמיה ברזולוציה גבוהה של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית ותאים מארחים13, הישרדות זחל והתמדה של CFU לאורך זמן.
טכניקת microinjection היא קריטית להצלחת פרוטוקול זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים בעת שימוש בציוד microinjection שונים והגדרות. בפרט, הלחץ וזמן ההזרקה הם שני משתנים עיקריים וניתן להתאים אותם כדי להבטיח כי נפח נפלט על ידי המחט הוא ~ 3 nL. גודל המחט כפי שנקבע על ידי גזירתו עם מלקחיים גם מסדיר את מספר הנבגים מוזרקים; אמנם, פתח גדול יותר יכול לגרום נזק לרקמות הזחל. מצד שני, קטן מדי של פתח לא יאפשר את הנבגים גדולים יחסית (>2 מיקרומטר) החוצה יכול להוביל סתימת מחט. אם זה קורה, המחט ניתן reclipped יש פתח קצת יותר גדול.
פרוטוקולים אחרים עבור microinjection של חיידקים לנצל PVP-40 כדי לסייע בשמירה על תערובת הזרקה הומוגנית, אבל לא מצאנו שום יתרון בשימוש במנשא זה עם נבגי אספרגילוס. סתימת המחט יכולה להיות מופחתת על ידי מערבולת ההכנה הפטרייתית ביסודיות כדי לשבור את כל גושים לפני טעינת המחט. לפעמים, סתימת המחט יכול גם להיות נעקר על ידי הגדלה זמנית של זמן הלחץ או ההזרקה והפעלת microinjector בעוד המחט היא בנוזל המקיף את הזחלים. הלחץ וזמן ההזרקה לאחר מכן צריך להיות ירד שוב לרמות קודמות. במקרים אחרים, לא ניתן להסיר סתימה, ומחט חדשה צריכה להיות טעונה וכיול מחדש.
פרוטוקול זה נועד להזריק ~ 30-70 נבגים לכל זחל. זה ידוע כי בהתבסס על הריכוז של הכנת הנבג ואת נפח מוזרק, מספר זה הוא נמוך למדי. עם זאת, נמצא באופן אמפירי כי זהו מספר הנבגים מוזרקים בתנאים אלה. מדוע הבדל זה מתרחש אינו ידוע, אבל זה יכול להיות בגלל נבג גושים במחט. הניסיונות שלנו להזריק מספר גדול יותר של נבגים לא צלחו ברובם.
כדי להבטיח כ 30-70 נבגים מוזרקים ולשמור על עקביות של זריקות בכל הזחלים, לבדוק את מספר הנבגים על ידי הזרקת על E3 המקיף את הזחלים. חזור על זה כל חמישה עד שישה זחלים לאורך כל הזריקות. אם ספירת הנבגים משתנה, ניתן להתאים את הלחץ ו/או זמן ההזרקה כדי להזריק מספר עקבי של נבגים על פני זחלים מרובים. עם זאת, יש להקפיד כי מינון ההזרקה נשאר בעיקר ב hindbrain ואינו ממלא את midbrain ו forebrain.
כדי להבטיח זיהום מקומי, ההשעיה נבג צריך להיות כלול בתוך החדר hindbrain. זה יכול להיות דמיינו על ידי כתמים אדומים פנול רק לאחר ההזרקה, אם כי הצבע האדום מתפזר עם הזמן. עבור זריקות, האזור סביב vesicle אוטי משמש לנקב דרך ולהגיע לחדר בזווית של 45°-65°. באזור זה אין כלי דם עיקריים, גורם פחות נזק לרקמות, ומרפא באופן מיידי. אם העור מעל החדר הוא פירסינג, ההשעיה נבג ניתן לדלוף החוצה, כי המחט שיש להשתמש בהם עבור זריקות נבג אספרגילוס הוא גדול יותר מזה משמש השעיות חיידקים. זחלים מוזרקים או פגומים בטעות יכולים להיות מסומנים על ידי הזרקת חלמון כמה פעמים כדי ליצור סימן אדום או על ידי גרירת הזחל מחוץ לשורה עם המחט. לאחר קבוצה של זריקות הושלמה, זחלים אלה יש להסיר ולהיפטר לפני השאר נשטפים מהצלחת. E3 ללא כחול מתילן משמש כדי להרדים זחלים לפני ההזרקה וגם לשמור זחלים לאחר הזריקות, כי כחול מתילן הוא אנטי פטרייתי.
בזמן ההזרקה, ספירות CFU מייצגות את מספר הנבגים הקיימים בתוך המארח הנגוע. עם זאת, אם הנבגים לנבוט לתוך hyphae, אלה יכולים להיות מחולקים נפרד קיימא "יחידות פטרייתיות" במהלך הומוגניזציה יכול להוליד מושבות מרובות. לחלופין, היפה רב-תאית רצופה יכולה להוליד מושבה אחת, וכתוצאה מכך ייצוג ממוצע, אך לא סביר, של הנטל הפטריוני. זה יכול להיות מקל על ידי שילוב ספירת CFU עם מיקרוסקופיה אורך של זחלים בודדים, אשר מספק נתונים חזותיים של גורלם של נבגים מוזרקים.
בהשוואה למערכת היונקים, מודל זיהום זחל הזברה משמעותי במיוחד בשל הנגישות האופטית שלו. הגיוס והתגובה של תאי חיסון מולדים ניתן לדמיין בתוך מארח שלם חי. זה יכול להיות משולב עם עיכוב גנטי או כימי של מטרות מולקולריות כדי לנתח כיצד כל מטרה משפיעה על תגובת מקרופאג ' או נויטרופילים נגד נבגי אספרגילוס בבעל חיים.
בעוד זחל זברה אספרגילוס מודל ההדבקה ממשיך להיות אינסטרומנטלי בתיאור היבטים שונים של IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, ישנם תחומים אחרים של התרחבות. מהצד המארח, הוא משמש לתיאור תגובות חיסוניות ברמה התאית, אך ניתן להרחיב זאת כדי לנתח מנגנונים חיסוניים ברמה המולקולרית על ידי שילובו עם מורפולינו ממוקד, CRISPR, קווי מוטנטים יציבים או חשיפה כימית. אזהרה אחת היא כי homologues עבור כל רכיבי מסלול חיסוני מולד יונקים ידועים לא זוהו זברה.
מצד הפתוגן תוארה ארסיות של מינים וזנים שונים. שדרה מבטיחה של מחקר עתידי היא השימוש בזני אספרגילוס מוטנטים כדי לבדוק כיצד גנים או חלבונים ספציפיים תורמים כגורמי ארסיות. ובכך, תרופות אנטי פטרייתיות חדשניות ניתן לפתח כדי למקד חלבונים אלה. תרופות אנטי פטרייתיות הנוכחי יש יעילות נמוכה בחולים אנושיים ויש עמידות גוברת לתרופות אלה פטריות28. מודל זה vivo יכול לשמש כדי לחקור מדוע תרופות אלה להיכשל כמודל ביניים כדי לבדוק את היעילות של תרופות אנטי פטרייתיות הרומן. בסך הכל, הממצאים שהתגלו באמצעות מודל זה יכולים להקל על פיתוח עתידי של טיפולים יעילים לחולים נגועים באספרגילוס.

Aspergillus fumigatus היא פטרייה סאפרופיטית בכל מקום, ואת הנבגים המוטסים שלה ניתן למצוא הן בפנים והן בחוץ1. נבגים אלה הם בשאיפה על ידי כולם אבל להיות פינה ביעילות מן הריאות של אנשים immunocompetent1,2. עם זאת, אנשים עם תנאי ריאות השתנו כגון סיסטיק פיברוזיס יכול לפתח אספרגילוזיס bronchopulmonary עקב נביטה פטרייתית בריאות3. הצורה החמורה ביותר של זיהום זה, אספרגילוזיס פולשני (IA), משפיע על אנשים immunocompromised וכרוך בצמיחה של הפטרייה לאיברים אחרים2,3. IA מוביל >50% מוות של חולים נגועים למרות הזמינות של טיפולים אנטי פטרייתיים4. אצל אנשים immunocompetent, תגובות חיסוניות מולדות לשחק תפקיד מרכזי בפינוי נבגים בשאיפה1. עם זאת, המנגנונים הספציפיים התורמים לסיווג חיסוני מולד זה אינם מובנים היטב. חשוב להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי חיסון מולדים מרכזיים (כלומר, מקרופאגים ונויטרופילים) באישור אספרגילוס על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור IA.
בעוד מודלים יונקים סייעו בזיהוי גורמי ארסיות פטרייתיים ומארחים תגובותחיסוניות 5,6, נגישות חזותית מוגבלת לאינטראקציות מארח-פתוגן ברמה התאית. ניסויים בתרבית רקמות אינם יכולים לשחזר באופן מלא את הסביבה הרב-תאית המורכבת ואת האינטראקציות הקיימות בבעלי חיים שלמים7. לכן, זברהפיש צברה פופולריות כאורגניזם מודל חלופי כדי למלא את הפער הזה ולאפשר את המחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן במארח חי, שלם על פני זיהום רב-יומי8,9. מערכת החיסון המולדת זברה מתפתחת כבר 24 שעות לאחר ההפריה (hpf)10, ואת המערכת האדפטיבית לוקח 4-6 שבועות לפתח11, מתן חלון זמן שבו תגובות חיסוניות מולדות ניתן להעריך בבידוד. תגובות חיסוניות מולדות שמורות היטב בין בני אדם לבין זברה דג11. זברהפיש יש תכונות רבות המאפשרות את החקירה של תגובות אלה, כולל בהירות אופטית (המאפשר הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של מארחים שלמים) ואת המתיחה הגנטית (אשר מקל על מחקרים מכניים מולקולריים).
מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה המתואר כאן פותח במקור על ידי נוקס ואח'12. זה הורחב לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו ואחרים לחקור מנגנונים חיסוניים מארחים12,13, המארח-פתוגן אינטראקציות13,14,15, מנגנונים של דיכוי המערכת החיסונית13,16,17, ארסיות פטרייתית18, ויעילות תרופה אנטי פטרייתית19,20. מודל זה מסכם היבטים מרובים של אספרגילוזיס אנושי. בעוד זחלים immunocompetent עמידים, זחלים immunocompromised יכול להיכנע לזיהום12,13,16,17.
במודל זה, זיהום מקומי נקבע על ידי הזרקת נבגים לתוך החדר hindbrain של זחל, אזור מאוכלס פחות עם phagocytes, גיוס phagocyte והתנהגות ניתן להעריך12,13. הוא האמין כי מקרופאגים לשמש קו ההגנה הראשון נגד נבגי אספרגילוס בבני אדם1 ומודלים יונקים6,21. באופן דומה, במודל הזברה, מקרופאגים מגויסים לנבגי אספרגילוס מוזרקים, בעוד נויטרופילים מגויסים באופן שני בתגובה לצמיחה מהפכלית12,13,22. ממודל זה, נודע גם כי אספרגילוס יכול להתמיד זחלים immunocompetent wildtype לאחר יותר מ 7 ימים של זיהום. יתר על כן, את כל מהלך הזיהום ניתן לעקוב באותם בעלי חיים חיים על ידי הדמיה קונפוקלית יומית.
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של microinjection להזריק נבגים לתוך החדר hindbrain של 2 ימים לאחר ההפריה (2 dpf) זחלים. הזיהום מנוטר לאחר מכן עד 7 ימים, כמו זחלים זברה יכול לחיות עד 10 dpf ללא האכלה. דיכוי המערכת החיסונית יכול להיגרם על ידי טיפול תרופתי, ואת היישום של תרופות לזחלים מתואר גם. לבסוף, מתוארות שתי שיטות למעקב אחר התקדמות הזיהום, כולל כימות של CFUs מזחלים בודדים והתקנת הדמיה חיה יומית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece reticle</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>RETR10</td>
			<td>For calibrating needles, used in Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector setup: Back pressure unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Footswitch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FTSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipet holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>M-Pip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator setup: Micromanipulator</td>
			<td>Narashige (Tritech)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand and plate</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>To homogenize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6380706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ65855-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L spreaders</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14 665 230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary needles (no filament)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-310</td>
			<td>To load the needle with Aspergillus suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM475855-1R</td>
			<td>To filter Aspergillus suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAL0669009</td>
			<td>To prevent pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 1% solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>57254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC118000500</td>
			<td>To anesthetize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Solutions</td>
			<td>Components/Recipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 media: 60x E3</td>
			<td>17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 &#183; 7H2O, to 1 L with H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x E3</td>
			<td>16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine stock solution</td>
			<td>2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 &#183; 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar</td>
			<td>10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Nitrate salts</td>
			<td>120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 &#183; 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace elements (TE)</td>
			<td>2.20 g ZnSO4 &#183; 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 &#183; 4H2O, 0.16 g FeSO4 &#183; 7H2O, 0.16 g CoCl2 &#183; 6H2O, 0.16 g CuSO4 &#183; 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 &#183; 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of zebrafish larvae with aspergillus spores for analysis of host-pathogen interactions

אספרגילוזיס פולשני (IA) הוא אחד הזיהומים הפטרייתיים הנפוצים ביותר בקרב אנשים immunocompromised. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, IA יכול לגרום >50% תמותה בחולים immunocompromised נגועים. זה חיוני כדי לקבוע הן גורמים מארחים ופתוגן התורמים רגישות לזיהום ושיעורי הישרדות נמוכים בחולים נגועים על מנת לפתח טיפולים חדשניים. תגובות חיסוניות מולדות ממלאות תפקיד מרכזי בהכרה וסיווג של נבגי אספרגילוס, אם כי מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים והמולקולריים המדויקים. מודלים אמינים נדרשים כדי לחקור אינטראקציות מכניות מפורטות בין המארח לפתוגן. הבהירות האופטית והמתיחה הגנטית של זחלי הזברה הופכים אותם למודל מסקרן לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן של זיהומים חיידקיים ופטריות אנושיים מרובים במארח חי ושלם. פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה. ראשית, נבגי אספרגילוס מבודדים ומוזרקים לתוך החדר האחורי של דג הזברה דרך מיקרו-אינג'ינג. לאחר מכן, מעכבים כימיים כגון תרופות לדיכוי המערכת החיסונית מתווספים ישירות למים הזחל. שתי שיטות כדי לפקח על הזיהום בזחלים מוזרקים מתוארים, כולל 1) הומוגניזציה של זחלים עבור המושבה להרכיב יחידה (CFU) ספירה ו 2) חוזר ונשנה, מערך הדמיה חיה יומית. בסך הכל, טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח באופן מכני את ההתקדמות של זיהום אספרגילוס vivo והוא יכול להיות מיושם על רקע מארח שונים זנים אספרגילוס לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן.

לאחר microinjection של נבגי אספרגילוס לתוך hindbrain של זחלים זברה, תוצאת זיהום יכול להיות ואחריו מבחנים מרובים, כולל הישרדות, CFUs, הדמיה חיה. במהלך מבחני ההישרדות, היה מעקב אחר מספר הזחלים הנגועים ששרדו 1-7 dpi. כאשר זחלים פראיים נותרו ללא טיפול, נצפה מעט מאוד מוות, כאשר כ-80%–100% מהזחלים שרדו את מות הניסוי כולו (איור 1). אם הזחלים היו מדוכאי חיסון, למשל על ידי חשיפה לתרופה קורטיקוסטרואידים dexamethasone (10 מיקרומטר), נצפתה ירידה משמעותית בהישרדות (איור 1).
כאשר יחידות CFUs כמתו לאורך כל הניסוי בן 7 הימים מזחלים מסוג בר נגועים בנבגי A. fumigatus, נצפתה התמדה של נבגים, עם סיווג איטי לאורך זמן (איור 2A). מספר הנבגים ששרדו ב- 1, 2, 3, 5 ו- 7 dpi מנורמל למספר הנבגים שהוזרקו ב- 0 dpi כדי להשוות התמדה וסיווג בין משכפלים (איור 2B).
קווי דגים מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בלוקוציטים יחד עם נבגי אספרגילוס מבטאי חלבונים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי לדמיין הן גיוס והתנהגות לויקוציטים והן נביטה פטרייתית וצמיחה13. כאשר מקרופאגים סומנו (למשל,Tg(mpeg1:H2B-GFP),,קיבוץ מאקרו ב- ~ 50% מהזחלים נצפה בדרך כלל, החל מ- 2-3 dpi (איור 3A). גיוס נויטרופילים(lyz:BFP)התעכב בדרך כלל, והתרחש בעיקר לאחר שנביטה פטרייתית התרחשה (איור 3A). בעוד נטל הפטריות נמשך במשך כל הניסוי ברוב הזחלים (איור 3A), נצפתה סיווג (איור 3B). בזחלים מסוימים, נטל פטרייתי מחוץ hindbrain נצפתה גם מאוחר יותר בזיהום, עקב הפצה פטרייתית, ככל הנראה מקרופאגים.
האזור סביב שקע האוטי הוא מקום אפשרי אחד שבו ניתן למצוא הפצה זו (איור 3C). תצפיות אלה כומתו במספר זחלים בודדים במהלך הניסוי כולו (איור 4). בדרך כלל, נביטה נראתה בכ-60% מהזחלים ב-5 dpi(איור 4A). אזור אשכול Phagocyte, גיוס מקרופאג', וגיוס נויטרופילים משתנים הן לאורך זמן והן על פני זחלים, עם כמה מגמות לאורך כל הניסוי וכמה פתרון לאורך זמן(איור 4B, C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg"> איור 1: ניתוח הישרדות מייצג של זחלים נגועים. זחלים נגועים באספרגילוסנחשפו לבקרת רכב (DMSO) או דקסמתזון (דקס), וההישרדות הייתה במעקב. הנתונים מייצגים שלושה עותקים משוכפלים במאגר. CFUs הזרקה ממוצעת: DMSO = 30, Dex = 29 (ערך p ויחס סיכון חושבו על ידי ניתוח רגרסיה סיכון פרופורציונלי קוקס, ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg"> איור 2: ספירת CFU מייצג מזחלים נגועים בודדים מיד לאחר ההזרקה (0 dpi) ובמהלך קורס ההדבקה (2, 3, 5 ו- 7 dpi). שמונה זחלים נגועים היו הומוגניים מצופים לספור CFU עבור כל נקודת זמן ולשכפל. (A) נתונים לדוגמה משכפל אחד. כל נקודה מייצגת זחל אחד, מייצגי פעילויות מייצגים אמצעים עבור כל נקודת זמן. (B) ספירות CFU נורמלו לספירת ה- CFU ב- 0 dpi עבור כל שכפול, ושלושה שכפולים אוגדו. הנתונים הושוו בין תנאים ניסיוניים באמצעות ניתוח שונות וסיכום במונחים של אמצעים שוליים משוערים ושגיאות סטנדרטיות. אסטריקס מייצגים מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- CFU ב- 0 dpi (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות מניסויי זיהום. זחלים שטופלו ב- PTU עם מקרופאגים פלואורסצנטיים (mpeg1:H2B-GFP) ונויטרופילים (lyz:BFP) הוזרקו עם RFP-מבטא A. fumigatus. זחלים חיים ונגועים צולמו שוב ושוב במיקרוסקופ קונפוקאלי 2, 3 ו-5 dpi. תמונות הקרנה בעוצמה מרבית Z מוצגות. שרטוטים של זחלים מציינים את מיקום ההדמיה עבור כל פאנל. כל סרגלי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר, למעט סרגלי קנה המידה של הכניסה, שהם 25 מיקרומטר. (A) תמונות המוצגות הן מזחל יחיד שנלקח ב- 2, 3 ו- 5 dpi, המייצג התקדמות זיהום טיפוסית. Insets להראות נביטה פטרייתית בימים 3 ו 5. (B) תמונה מייצגת של תת קבוצה של זחלים שיכולים לנקות את הזיהום, עם נטל פטרייתי נמוך ולא הרבה דלקת ב 5 dpi. (C) תמונה מייצגת של קבוצת משנה של זחלים שבה הזיהום מתפשט מתוך hindbrain בנקודות זמן מאוחרות יותר. בתמונה זו, פטרייה, מקרופאגים ונויטרופילים ניתן למצוא סביב ומתחת לווציקל אוטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg"> איור 4: כימות מייצג של ניסויי הדמיה. תמונות ממערך ניסיוני באיור 3 נותחו לצורך נביטה פטרייתית וגיוס לויקוציטים. זחליםהובקעו על נוכחותם של נבגים מונבטים בכל יום, ואחוז הזחלים עם הנביטה חושב. (B, C,D) כל זחל בודד מיוצג כקו צבע שונה. המראה והגודל של אשכול Phagocyte (B), גיוס מקרופגים (C) וגיוס נויטרופילים (D) לוו במהלך הניסוי בן 5 הימים עבור כל זחל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס בזחלים זברה. נבגי אספרגילוס הם microinjected לתוך hindbrain של זחלים, טיפול כימי משמש כדי לגרום לדיכוי המערכת החיסונית. התקדמות הזיהום מנוטרת באמצעות מערך הדמיה יומי כדי לפקח על צמיחה פטרייתית ותגובות חיסוניות, כמו גם ספירה של נבגים חיים על ידי ציפוי יחידה יוצר מושבה.

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...