Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Yazarlar, Dartmouth'daki Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) personeline, bu çalışmalar için kullanılan farelere gösterdikleri uzman bakım için teşekkür eder. Bornstein Araştırma Fonu bu araştırmayı finanse etti.

Tüm hayvan çalışmaları, Dartmouth'daki Geisel Tıp Okulu'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilen ve onaylanan protokolleri kullanır.
1. Dekalsifikasyon için beyin ve omurilik örneklerinin işlenmesi
<ol><li>Beyin ve omurilik örneklerinin izole edilmesi
	<ol><li>Fareyi CO2 inhalasyonu yoluyla ötenazi yapın. CO2 akış hızının dakikada kafes hacminin %10-30'unu değiştirdiğinden emin ol...

Homeostaz ve hastalık sırasında CNS bölmesindeki hücresel bileşimi değerlendirme yöntemleri, CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumlarını anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, CNS'de önemli bir bariyer görevi görmesine ve çeşitli bağışıklık hücrelerini barındırmasına rağmen, beyin ve omurilik için birçok geleneksel doku ekstraksiyon yöntemi bu zarların toplanmasına izin vermediğinden, meninksler genellikle analizden çıkarılır. Bu ihmal, meninkslerin hücresel bileşimi ve işlevi i...

Merkezi sinir sistemi (CNS) immünolojik olarak özelleşmiş bir bölgedir. CNS parankimi, BOS boşluğu, meninksler ve vaskülatür hariç, klasik olarak bağışıklık ayrıcalıklı bir bölge 1,2,3,4,5 olarak görülür ve homeostatik koşullar 2,6,7 sırasında nispeten bağışıklık hücrelerinden yoksundur. Buna karşılık, dura, araknoid ve pia tabakalarından oluşan meninksler, hastalık patogenezisırasında homeostatik immün sürveyans ve enflamatuar süreçlere aktif olarak katılan CNS bölmesinin önemli bileşenleridir 3,6,7,8. Kararlı durum koşulları sırasında, meninksler, doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC), makrofajlar, dendritik hücreler (DC), mast hücreleri, T hücreleri ve daha az ölçüde B hücreleri 9,10,11 dahil olmak üzere çok sayıda immün sentinel hücreyi destekler.
Meninksler oldukça vaskülarize yapılardır ve CNS ile çevresi arasında lenfatik bir bağlantı sağlayan lenfatik damarlar içerir 8,12,13,14. CNS hasarı, enfeksiyonlar, otoimmünite ve hatta nörodejenerasyonun neden olduğu enflamatuar durumlarda, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankimmaya sızar ve meninksler içindeki bağışıklık manzarasını değiştirir. Hücre infiltrasyonunu takiben, meninksler, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri için fonksiyonel bir nişi temsil edebilir, bağışıklık hücresi agregasyonunu, lokal bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve CNS bölmesinde uzun süreli sağkalımı teşvik edebilir. Multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere CNS'yi etkileyen birçok hastalıkta belirgin meningeal inflamasyon gözlenir.15,16,17,18,19, inme 20,21, steril yaralanma 22,23 (yani, omurilik yaralanması ve travmatik beyin hasarı), migren 24 ve mikrobiyal enfeksiyon 25,26,27,28,29. Bu nedenle, meningeal kompartmandaki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş immün hücrelerin karakterizasyonu, bu hücrelerin kararlı durum koşulları ve hastalık patogenezi sırasındaki rolünü anlamak için gereklidir.
Kafatası ve omur gövdelerinden beyin, omurilik ve meninkslerin çıkarılması teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Şu anda, üç meningeal tabakanın tümü bozulmadan beynin hızlı bir şekilde çıkarılması için herhangi bir teknik bulunmamaktadır. Laminektomi mükemmel omurilik dokusu morfolojisi sağlarken ve meningeal tabakaları korurken, hem son derece zaman alıcı hem de karmaşıktır30,31. Tersine, beynin kafatasından çıkarılması ve omuriliğin hidrolik ekstrüzyonu gibi daha geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, CNS dokusunun hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırır, ancak bu tekniklerle hem araknoid hem de dural meninksler kaybolur30,31. Beyin ve omurilik dokularının konvansiyonel izolasyonu sırasında dura ve araknoid tabakaların ihmal edilmesi, CNS bölmesindeki hücrelerin eksik bir analizine neden olur. Bu nedenle, sağlam meninksli CNS dokularının hızlı ekstraksiyonuna odaklanan yeni tekniklerin tanımlanması, CNS bölmesinin optimal analizi için çok önemlidir.
Bu el yazması, farelerden beyin, omurilik ve meninkslerin hızlı bir şekilde çıkarılması için iki yöntem sunarak, CNS parankimi ve meninkslerinde yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin aşağı akış analizini kolaylaştırır. Bu optimize edilmiş protokoller, 1) aşağı akış analizi için tek hücreli süspansiyonların izole edilmesine ve 2) dokuların histolojik işleme için hazırlanmasına odaklanır. Beyinden, omurilik dokusundan ve dural ve araknoid meninkslerden tek hücreli süspansiyonların elde edilmesi32, hem parankimal hem de meningeal bölmelerde bulunan hücrelerin aynı anda analizine izin verir. Tek hücreli süspansiyonlar, in vitro stimülasyon 33, enzime bağlı immünospot (ELISpot)28,34,35, akış sitometrisi 36,33 ve tek hücreli 37 veya toplu transkriptomik gerçekleştirmek için hücre kültürü testleri dahil olmak üzere farklı uygulamalarda kullanılabilir. Ek olarak, sırasıyla sağlam kafatasları veya vertebral sütunlarla tüm beyinlerin ve omuriliklerin dekalsifikasyonu için optimize edilmiş protokol, meninksleri sağlam bırakarak ve doku morfolojisini koruyarak çevredeki kemiğin nazikçe dekalsifikasyonuna izin verir. Bu yöntem, hem parankimal hem de meningeal boşluklarda immünohistokimya (IHC) veya in situ hibridizasyon (ISH) teknikleri kullanılarak proteinlerin veya RNA'nın seçici olarak tanımlanmasına izin verir. CNS içindeki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin fenotipinin, aktivasyon durumunun ve lokalizasyonunun karakterizasyonu, CNS bölmesindeki bireysel hücre tiplerinin homeostaz ve hastalık patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerekli bilgileri sağlayabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

Merkezi sinir sistemi (MSS) beyin ve omurilikten oluşur ve çevre ile CNS arasında bir bariyer görevi gören zarlı tabakalar olan meninksler tarafından sarılır. CNS, immünolojik olarak uzmanlaşmış bir bölgedir ve kararlı durum koşullarında, bağışıklık ayrıcalığı en çok CNS parankiminde belirgindir. Buna karşılık, meninksler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli yerleşik hücreler barındırır. CNS hasarı, otoimmünite, enfeksiyon ve hatta nörodejenerasyon ile tetiklenen enflamatuar durumlar sırasında, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankima girebilir ve meninksler içinde ikamet edebilir. Bu hücrelerin CNS hastalığı patogenezi sırasında hem yararlı hem de zararlı eylemler gerçekleştirdiği düşünülmektedir. Bu bilgiye rağmen, CNS bölmesini analiz ederken meninksler genellikle göz ardı edilir, çünkü geleneksel CNS doku ekstraksiyon yöntemleri meningeal tabakaları atlar. Bu protokol, tek hücreli teknikler, immünohistokimya ve in situ hibridizasyon yöntemleri ile aşağı akış analizi için uygun olan murin CNS dokularının (yani beyin, omurilik ve meninksler) hızlı izolasyonu için iki farklı yöntem sunar. Açıklanan yöntemler, homeostatik koşullar altında ve hastalık patogenezi sırasında CNS bölmesini işgal eden hücrelerin fenotipini, işlevini ve lokalizasyonunu değerlendirmek için ideal olan CNS dokularının kapsamlı bir analizini sağlar.

Bu temsili deney, B ve T hücrelerini ölçmeyi ve homeostatik koşullarda meningeal ve parankimal CNS kompartmanlarında B ve T hücresi lokalizasyonunu tanımlamayı ve ayrıca bir murin progresif MS modelinde (yani, TMEV-IDD) tanımlamayı amaçladı. TMEV-IDD, 5 haftalık dişi SJL farelerinde, daha önce tarif edildiği gibi TMEV BeAn'ın 5 x 106 plak oluşturan birimi (PFU) ile intrakraniyal enfeksiyon ile indüklenmiştir29.
Bu çalışmada, enfeksiyon...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Rapid isolation of CNS tissues including the meninges allows for a comprehensive analysis of immune cell phenotype, function, and localization in homeostatic and pathogenic conditions. The two demonstrated methods allow for the quick extraction of CNS tissues with the meninges, ideal for downstream analysis using single cell techniques and histological methods. Although the representative results focus on the analysis of immune cells, these two methods can be used to analyze CNS resident cells, including microglia, astrocytes, pericytes, endothelial cells, stromal cells, and neurons.Begin by isolating brain and spinal cord samples from euthanized mice. After removing the head, make a midline incision in the skin and flip it over the eyes to free the skull. Cut at the nasal bone to release the mandible from the skull.Then remove the mandible, tongue, and eyes. Cut along the lateral aspects of the skull to release the tissue along the external auditory meatus and trim it. To collect the spinal cord sample, separate the rib cage from the spinal column by cutting parallel to the spine with sharp scissors.Make a small cut at the lower lumbar region to isolate the spinal column, then trim and remove any remaining muscle along the spine to expose the vertebrae. When performing decalcification, check the bone daily to determine if it is soft and pliable. Remove the tissue from the EDTA solution with forceps, place it on a Petri dish, and gently test the bone softness with a 25 gauge needle.If the needle easily penetrates the bone, the decalcification process is complete. To extract the skull cap in the brain, make a midline incision in the skin and flip the skin over the eyes. Place the scissors within the foramen magna and begin cutting the skull laterally along the cortices towards the olfactory bulb, keeping the incisions above the external auditory meatus and mandible.Perform the same cuts on the opposite side with cuts meeting at the olfactory bulb to free the skull cap from the brain. Using forceps, peel back the skull cap and place it into a 15 milliliter conical tube containing five milliliters of cold RPMI medium supplemented with 25 millimolar HEPES. Place curved forceps below the base of the brain and lift them to free the brain from the skull cap.Extract the vertebrae column and spinal cord tissue by cutting parallel to the spine to separate the rib cage from the spinal column. Then make a small cut at the lower lumbar region to isolate the vertebrae column. Trim and remove any remaining muscle along the spine to expose the vertebrae.Next, place the extra fine surgical scissors within the vertebral column and cut along the lateral edge of the column. Cut the opposite lateral edge completely to divide the vertebral column into an anterior and posterior portion. Use forceps to peel away the spinal cord slowly and carefully from the vertebral column and place it in a 15 milliliter conical tube containing five milliliters of cold RPMI with 25 millimolar HEPES.Then transfer the anterior and posterior portions of the spinal column to another tube. To remove the meninges from the skull cap, take the skull cap out of the RPMI media and use sharp forceps to score around the outer edge. Peel the meninges away from the edge of the skull cap, scraping to remove the dural and arachnoid meninges and place the meninges on a Petri dish.To remove the meninges from the vertebral column, take the column out of the media and score around the edges of the vertebral column with sharp forceps to free the meninges. Use curved forceps to peel away the meninges from the edge of the vertebrae and place the meninges on a Petri dish. Place a nylon mesh strainer in a 50 milliliter conical tube.To create a cell suspension, move the meninges into a strainer and add three milliliters of HEPES supplemented RPMI, then use a plunger from a five milliliter syringe to grind the tissue and media through the strainer. Pour the brain or spinal cord tissue with the media into a 100 millimeter Petri dish and use forceps to move the tissue to the bottom. Mince the brain tissue with a sterile razor blade and gather the tissue at the bottom of the plate.Add three milliliters of RPMI supplemented with 10%FCS to the Petri dish, then use a 10 milliliter serological pipette to resuspend the tissue in the media and transfer it to a 15 milliliter conical tube. Add collagenase type 1 and DNase 1 to the tissue and incubate the tubes in a 37 degree Celsius water bath for 40 minutes. Invert the tubes every 15 minutes to thoroughly mix the tissue with the enzymes.After incubation, add EDTA to each tube for a final concentration of 0.01 molar and incubate the tubes for an additional five minutes to inactivate the collagenase. Add nine milliliters of RPMI supplemented with 10%FCS to each tube, then centrifuge the tubes at 450 G for five minutes at four degrees Celsius. Use a Pasteur pipette with a vacuum to aspirate the supernatant, taking care not to touch the cell pellet.Add three milliliters of 100%stock isotonic density gradient solution to the cell pellet, then add additional RPMI 10%FCS media to bring the final volume to 10 milliliters and resuspend the cell pellet. Invert and mix the tube well, then insert a serological pipette with one milliliter of 70%stock isotonic density gradient solution into the bottom of the tube. Slowly underlay the solution, being careful not to make bubbles.Remove the serological pipette from the tube, making sure not to disturb the gradient. Centrifuge the tube at 800 G for 30 minutes at four degrees Celsius, then aspirate the supernatant, including the myelin debris layer, until two to three milliliters remain in the tube. Use a one milliliter pipette to harvest the cell layer between the 30%and 70%density gradient and transfer it to a new 15 milliliter tube.Add RPMI 10%FCS media to bring the final volume to 15 milliliters, then centrifuge the cells at 450 G for five minutes at four degrees Celsius. This protocol was used to assess B and T cells in the meninges, brain, and spinal cord during progressive multiple sclerosis. Gating was conducted to distinguish CD45 high peripherally derived infiltrating immune cells from CD45 low microglia and CD45 negative neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.Few CD45 high cells were present in the spinal cord and brain tissue of sham-treated mice. The same gating cutoff for CD45 high expression was used in the meninges to identify CD45 high immune cells and exclude non-immune cells. In all TMEV-IDD CNS tissues, increased percentages of CD45 high immune cells were observed compared to sham treated mice.During chronic TMEV-IDD, the percentage of B cells among CD45 high immune cells in the brain and spinal cord was higher compared to the meningeal compartment. Decalcified brains and spinal cords were imaged to identify the localization of B and T cells within the CNS compartment. Conventional extraction of the brain from the skull cap resulted in an intact pia layer, but the remaining meningeal layers were excluded.In both decalcified brains and spinal cords, all meningeal layers were intact. Isotype switched B cells and T cells were localized with IgG and CD3 expression, respectively. Costaining IgG with ER-TR7 revealed that B cells were present in the CNS parenchyma and the meninges, while cellular aggregates within ER-TR7 positive meninges contained multiple IgG positive B cells and CD3 positive T cells.A critical step in these protocols is the careful extraction of the CNS tissues, essential for improving the purity of single cell suspensions and for obtaining histology tissue with high quality morphology. The described techniques allow for the comprehensive analysis of cells occupying the CNS compartment, ideal for examining cell phenotype, function, and localization under homeostasis and during disease pathogenesis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Merkezi Sinir Sistemine İntranazal siRNA Teslimi Sırasında Farelerin Yerleştirilmesi için Bir Konumlandırma Cihazı

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...