circadian 시간을 정의 하는 Drosophila 동기화 는 생물학적 시계에 제어 하거나 응답 하는 이벤트를 공부에 첫 번째 단계. 모든 모델의 동기화는 동일한 기본 접근 방식을 따릅니다. 이 실용적인 작업을 수행하는 많은 단계가 있으며, 그들 모두를 함께 넣어 압도적 인 것처럼 보일 수 있습니다.
자연스러워지기 전에 몇 번 시도해 볼 것으로 예상됩니다. 온도를 안정적으로 유지하고 3 분 동안 빛을 꺼내고 싶습니다. 121도에서 크록 냄비에 플라이 푸드를 준비하여 재료가 첨가될 때 섞습니다.
크록 냄비를 덮고 내용물들을 끓여 10분마다 섞어 끓입니다. 20분 동안 끓인 후, 불을 끄고 83.6 밀리리터의 물을 크록 냄비에 넣습니다. 음식이 식으면 뚜껑을 벗어 두십시오.
음식이 식는 동안 10분마다 저어서 필름이 상단에 형성되는 것을 방지합니다. 또한 유리 온도계로 10 분마다 온도를 측정합니다. 음식이 섭씨 60도 이하로 식으면 원고에 설명된 대로 테고프산과 프로피오닉산을 추가합니다.
잘 섞어서 크록 냄비를 조정하여 온도를 유지하며 섭씨 60도 미만입니다. 연동 펌프를 사용하여 플라이 푸드를 분배합니다. 좁은 바이알의 경우 10 밀리리터를 펌핑하고 6 온스 평방 바닥 병을 위해 60 밀리리터를 펌핑하십시오.
10~12일 동안 25도의 야생식 파리를 저장하면 병 안쪽에 약 200마리의 강아지가 부착됩니다. 병에서 성인을 제거하려면 새로운 병에 팁을 주고 숫자 0 페인트 브러시의 둔한 끝을 사용하여 남은 성인을 밀어 넣습니다. 사용 전후 70%에탄올로 페인트브러시를 닦으십시오.
다음 세대가 출현할 수 있도록 섭씨 25도에서 푸파를 배양합니다. 3일 후, 파리는 0~3일 된 날입니다. 온도, 빛, 심지어 음식의 선택의 엔훈련에 영향을 미칠 것입니다 기억하십시오.
실험 중에 각 컨트롤을 유지하십시오. 수집을 위해 지정된 시점에서 이산화탄소 마취 패드를 사용하여 파리를 고정하고 남성 100명과 암컷 100마리를 모으세요. 암컷 파리는 남성보다 훨씬 큽습니다.
파리는 또한 생식기를 검사해서 분화될 수 있습니다. 남성은 어두운 둥근 생식기를 가지고, 여성은 가볍고, 더 뾰족한 생식기를 가지고있는 반면. 병병 당 100 명의 암컷과 바이알 당 50 명의 남성과 별도의 바이알에 남성과 여성을 배치하십시오.
남성 사회적 상호 작용은 유리병에 있는 100명의 개별이 있을 때 많은 죽음으로 이끌어 냅니다. circadian entrainment가 발생할 수 있도록, 3 ~ 5 일 동안 빛 조절 인큐베이터에 바이알을 배치합니다. 미래의 훈련을 위해 파리를 생산하려면 남은 암컷 25명과 나머지 수컷 5~7마리를 새 병에 담아 놓습니다.
병을 섭씨 25도에서 배양합니다. 수집될 100개의 파리마다. 고정의 4.8 밀리리터를 추가하여 좁은 바이알을 준비합니다.
좁은 바이알을 얼음 양동이에 놓고 양동이, 종이 타월, 호일 및 테이프를 인큐베이터에 가져 가십시오. 파리를 수집하려면 좁은 유리병에 깔때기를 넣은 다음 파리 바이알에서 캡을 제거하고 빠르게 깔때기로 반전시다. 부드럽게 탭하여 파리를 고정 유리병으로 안내합니다.
수컷을 모을 때, 50마리의 바이알 두 개를 하나의 좁은 유리병에 결합합니다. ZT13 및 ZT19용 바이알을 호일에 싸서 싸는다. 파리를 옮은 후, 유출을 방지하기 위해 캡을 제자리에 테이프로 놓습니다.
누다링 믹서에 바이알을 165 RPM, 섭씨 4도에 4시간 동안 놓습니다. 파리는 더 이상 빛에 민감하지 않으므로 호일을 제거하여 파리가 고정물에 잠겨 있는지 확인할 수 있습니다. 누다링 믹서에서 바이알을 제거 한 후 포름알데히드를 제거 한 다음 1X PBS의 3000 마이크로 리터로 파리를 세 번 씻고 각 세척 중에 유리병을 반전시라.
바이알을 섭씨 4도에 저장하여 향후 면역 불경을 기다립니다. 빛과 어둠은 일주기에 파리를 감싸는 데 사용되었다. 감발은 경유단백질의 면역형질 및 면역형광분석에 의해 검증되었으며, 이는 일주기의 엔트레인을 위한 마커이다.
전체 세포 추출물의 면역 블로팅은 훈련된 파리의 머리로부터 제조된 기간 단백질 이동성 및 강도의 정식 패턴을 나타낸다. ZT1에서 수집된 훈련된 두뇌의 면역 형광은 특징적인 패턴에 있는 기간 단백질을 보여줍니다. 이 방법은 면역형광, 면역부동, 면역침전, 행동 분석 및 생물학적 시계가 진드기로 경로가 어떻게 변하는지 비교하기 위해 사용할 수 있는 다른 기술에 대한 점점이다.
모델 유기체를 훈련할 수 있는 능력으로, 시간이 지남에 따라 좋아하는 통로가 변하는지, 좋아하는 통로의 효과가 생물학적 중단으로 이어질 수 있는지 물어볼 수 있습니다. 생물학적 시계가 중단되면 여러 가지 질병이 악화됩니다. 근본적인 기계장치를 확인하는 것은 우리가 알츠하이머병과 파킨슨병과 같은 질병으로 고통받는 사람들을 위한 더 효과적인 약을 만드는 데 도움이 될 것입니다.
