Name: in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

De auteurs danken Mevrouw Kaylee Smith, Mevrouw Lauren Kwok, en de heer Alexander Floru voor het proeflezen van het manuscript. H.F. erkent steun van de NIH (CA134743 en CA215059), de American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) en de St. Baldrick's Foundation. F.J.F.L. erkent een beurs van Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S erkent NSF-steun (subsidie CBET 1605405) en NIH R41AI142890.

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Boston University School of Medicine onder het protocol #: PROTO201800543.
1. Generatie van Casper zebravis embryo's
<ol><li>Kies volwassen Casper vissen die ten minste 3 maanden oud zijn voor natuurlijke fokkerij om transparante Casper zebravis embryo's te genereren.</li>
	<li>Vul twee-kamer paring tanks met viswater in de avond, scheiden de bovenste tanks met ...

<ol>
	<li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer.">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li><li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer.">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li><li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers,+Cells,+and+Tissues+by+Fluorescence.">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li><li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer.">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li><li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models:+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes.">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li><li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research.">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases.">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis.">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li><li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish.">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hela+Cells:+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle.">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li></ol>

Het hier beschreven protocol maakt gebruik van de zebravis als een in vivo systeem om het vermogen van nanodeeltjes te testen om uitgezaaide menselijke kankercellen te herkennen en te targeten. Verschillende factoren kunnen van invloed zijn op de succesvolle uitvoering van de experimenten. Ten eerste moeten embryo's volledig ontwikkeld worden met 48 pk. De juiste ontwikkelingsfase van de embryo's stelt hen in staat om de transplantatie van menselijke kankercellen te verdragen en te overleven. Embryo's jonger dan 48 pk he...

De ontwikkeling van nanodeeltjes die in staat zijn om kankercellen te detecteren, te richten en te vernietigen is van groot belang voor zowel natuurkundigen als biomedische onderzoekers. De opkomst van nanogeneeskunde leidde tot de ontwikkeling van verschillende nanodeeltjes, zoals die vervoegd met gerichte liganden en/of chemotherapeutische geneesmiddelen1,2,3. De toegevoegde eigenschappen van nanodeeltjes maken hun interactie met het biologische systeem, het waarmaken en monitoren van biologische gebeurtenissen met een hoge efficiëntie en nauwkeurigheid, samen met therapeutische toepassingen mogelijk. Goud en ijzeroxide nanodeeltjes worden voornamelijk gebruikt in computertomografie en magnetische resonantie imaging toepassingen, respectievelijk. Terwijl de enzymatische activiteiten van goud en ijzeroxide nanodeeltjes het mogelijk maken de detectie van kankercellen door middel van colorimetrische tests, fluorescerende nanodeeltjes zijn zeer geschikt voor in vivo imaging toepassingen4. Onder hen, ultrabright fluorescerende nanodeeltjes zijn bijzonder gunstig, vanwege hun vermogen om kankers vroeg op te sporen met minder deeltjes en verminderde toxiciteiten5.
Ondanks deze voordelen vereisen nanodeeltjes experimenten met in vivo diermodellen voor de selectie van geschikte nanomaterialen en optimalisatie van het syntheseproces. Bovendien, net als geneesmiddelen, nanodeeltjes vertrouwen op dierlijke modellen voor preklinische testen om hun werkzaamheid en toxiciteit te bepalen. Het meest gebruikte preklinische model is de muis, een zoogdier waarvan het onderhoud relatief hoge kosten met zich meebrengt. Voor kankerstudies worden genetisch gemanipuleerde muizen of xenografted muizen meestal gebruikt6,7. De lengte van deze experimenten strekt zich vaak uit van weken tot maanden. In het bijzonder worden kankercellen voor kankermetastasestudies rechtstreeks geïnjecteerd in de bloedsomloop van de muizen op locaties zoals staartaderen en milt8,9,10. Deze modellen vertegenwoordigen alleen de eindstadia van metastase wanneer tumorcellen buitenaardsen en koloniseren verre organen. Bovendien, als gevolg van zichtbaarheid problemen, is het bijzonder uitdagend om tumorcel migratie en nanodeeltjes targeting van tumorcellen in muizen te controleren.
De zebravis (Danio rerio) is uitgegroeid tot een krachtig gewerveld systeem voor kankeronderzoek als gevolg van zijn hoge haalbaarheid, lage kosten, snelle ontwikkeling, optische transparantie, en genetische instandhoudingen11,12. Een ander voordeel van de zebravis ten opzichte van het muismodel is de bevruchting van de viseieren ex utero, waardoor de embryo's gedurende hun ontwikkeling kunnen worden gecontroleerd. Embryonale ontwikkeling is snel in zebravissen, en binnen 24 uur na de bemesting (hpf), de gewervelde lichaam vliegtuig heeft al gevormd13. Met 72 pk komen eieren uit het chorion en gaan ze van het embryonale naar het bakstadium. De transparantie van de zebravis, de Casper-stam in het bijzonder14, biedt een unieke kans om de migratie van kankercellen en hun erkenning en targeting door nanodeeltjes in een levend dier te visualiseren. Ten slotte ontwikkelen zebravissen hun aangeboren immuunsysteem met 48 pkf, waarbij het adaptieve immuunsysteem achterblijft en pas functioneel wordt na 28 dagen na de bemesting15. Deze tijdskloof is ideaal voor de transplantatie van verschillende soorten menselijke kankercellen in zebravisembryo's zonder immuunafstotingen te ervaren.
Hier beschreven is een methode die gebruik maakt van de transparantie en snelle ontwikkeling van zebravissen om de erkenning en targeting van menselijke kankercellen door fluorescerende nanodeeltjes in vivo aan te tonen. In deze test werden menselijke baarmoederhalskankercellen (HeLa-cellen) genetisch gemanipuleerd om een rood fluorescerend eiwit uit te drukken geïnjecteerd in het gevasculariseerde gebied in de perivitellineholte van 48 hpf embryo's. Na 20-24 uur hadden de HeLa cellen zich al verspreid over de embryo's door de bloedsomloop van vissen. Embryo's met schijnbare metastase werden microinjected met ~0.5 nL van een nanodeeltjesoplossing direct achter het oog, waar het rijke capillaire bed zich bevindt. Met behulp van deze techniek, de ultrabright fluorescerende silica nanodeeltjes kunnen richten HeLa cellen zo snel als 20-30 min postinjectie. Door zijn eenvoud en effectiviteit vertegenwoordigt de zebravis een robuust in vivo model om een verscheidenheid aan nanodeeltjes te testen op hun vermogen om specifieke kankercellen te targeten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer and monitor</td>
			<td>ThinkCentre</td>
			<td>X000335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35960-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MMPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX-10 fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 tip</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SB93102</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>50-998-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYSPV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche-Sigma-Fisher</td>
			<td>50-100-3275</td>
			<td>Roche product made by Sigma- sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ51 dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Western Chemicals</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish

Het ontwikkelen van nanodeeltjes die kankercellen kunnen detecteren, richten en vernietigen is van groot belang op het gebied van nanogeneeskunde. In vivo diermodellen zijn nodig voor het overbruggen van de nanotechnologie tot de biomedische toepassing ervan. De muis vertegenwoordigt het traditionele diermodel voor preklinische tests; muizen zijn echter relatief duur om te houden en hebben lange experimentele cycli vanwege het beperkte nageslacht van elke moeder. De zebravis is ontstaan als een krachtig modelsysteem voor ontwikkelings- en biomedisch onderzoek, waaronder kankeronderzoek. Met name vanwege de optische transparantie en snelle ontwikkeling zijn zebravisembryo's zeer geschikt voor real-time in vivo monitoring van het gedrag van kankercellen en hun interacties met hun micro-omgeving. Deze methode is ontwikkeld om achtereenvolgens menselijke kankercellen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes in transparante Casper zebrafish embryo's te introduceren en in vivo herkenning en targeting van de kankercellen door nanodeeltjes in real time te monitoren. Dit geoptimaliseerde protocol toont aan dat fluorescerend gelabelde nanodeeltjes, die zijn gefunctionaliseerd met foliumzuurgroepen, specifiek gemetastaseerde menselijke cervicale epitheelkankercellen kunnen herkennen en targeten die zijn voorzien van een ander fluorchroom. De erkenning en targeting proces kan plaatsvinden al 30 min postinjectie van de nanodeeltjes getest. Het hele experiment vereist alleen het fokken van een paar paar volwassen vissen en duurt minder dan 4 dagen om te voltooien. Bovendien missen zebravisembryo's een functioneel adaptief immuunsysteem, waardoor een breed scala aan menselijke kankercellen kan worden geëntreerd. Vandaar dat het nut van het hier beschreven protocol het testen van nanodeeltjes op verschillende soorten menselijke kankercellen mogelijk maakt, waardoor de selectie van optimale nanodeeltjes in elke specifieke kankercontext voor toekomstige tests bij zoogdieren en de kliniek wordt vergemakkelijkt.

Het protocolschema in figuur 1 illustreert de algemene procedures voor deze studie. Transparante Casper mannelijke en vrouwelijke volwassen vissen werden gefokt om embryo's te genereren (sectie 1). RFP+ HeLa cellen werden geïnjecteerd in het gevasculariseerde gebied onder de perivitelline holte van de zebravis embryo's op 48 hpf, met niet-geïnjecteerde embryo's als controles (sectie 3). Voor personen die ervaring hebben met microinjectie is de over...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Hier beschreven is een methode voor het gebruik van zebravis embryo's om het vermogen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes te bestuderen om menselijke kankercellen in vivo richten. Deze methode maakt de evaluatie en selectie van optimale nanodeeltjes mogelijk voor toekomstige tests bij grote dieren en in klinische proeven.

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Deze procedure stelt onderzoekers in staat om optimale nanodeeltjes te evalueren en te selecteren voor studies bij grote dieren en klinische proeven. Deze eenvoudige methode helpt bepalen of de nanodeeltjes kan richten op de menselijke kankercellen in vivo en zo ja, hoe efficiënt de targeting is. Het aantonen van de procedures zal Dr.Xiodan Qin, een postdoc, en de heer Andrew Lam, een onderzoekstechnicus van ons lab.Vul 's avonds twee kamerparingtanks met viswater en scheid de bovenste tanks met verdelers. Plaats een mannelijke zebravis in de ene kant van de kamer en een of twee vrouwtjes zebravis in een andere kant van de kamer. Verwijder de verdelers om 8:00 uur de volgende ochtend.Voeg kunstmatige verrijkingsinstallaties toe en kantel de bovenste kamer iets om een ondiep gebied van water te creëren. Laat de zebravis drie tot vier uur broeden en verzamel de eieren uit de onderste kamer door het water door een gaasnet te gieten. Breng de eieren naar een petrischaaltje met niet meer dan 200 eieren per gerecht.Verwijder dode of onbevruchte eieren. Vul de schotel twee derde vol met vers viswater en plaats het in de couveuse. Haal na 24 uur de schaal uit de couveuse en haal zoveel mogelijk water uit de schaal.Voeg een paar druppels van een milligram per milliliter pronaza oplossing en zachtjes wervelen de schotel. Wanneer de chorions tekenen van desintegratie vertonen, pipette de embryo's op en neer een paar keer af te breken de chorions en laat de embryo's. Zodra de meerderheid van de embryo's uit de chorions zijn, voeg onmiddellijk vers viswater toe om het proces te beëindigen.Spoel de embryo's drie keer met viswater om de drijvende chorions te verwijderen Breng de embryo's terug naar de couveuse. Maak een 3%agarose oplossing door het toevoegen van drie gram elektroforese-grade agarose tot 100 milliliter autoclaved viswater. Microgolf agarose en water tot de agarose volledig wordt opgelost.Om de injectieplaat te maken, giet hete agarose oplossing in een petrischaaltje totdat het driekwart vol is en plaats de micro-spuitgietmatrijs op de agarose. Nadat de agarose is gestold, verwijder voorzichtig de mal. Vul de resulterende injectieplaat met autoclaved viswater en bewaar het op vier graden Celsius.Om de injectienaalden te maken, trekt u de glazen haarvaten van 0,78 millimeter aan een pipettrekker met een oppervlakte van 0,78 millimeter. Bewaar de injectienaalden op stopverf in een grote petrischaal die is afgeveegd met een ethanolhanddoek. Voordat u de HeLa-cellen oogst, warmt u de injectieplaat en het viswater in de couveuse op bij 35,5 graden Celsius.30 minuten tot een uur voor de transplantatie, oogst de HeLa cellen. Werken in een weefsel cultuur kap, verwijder het medium uit de kolf door aspiratie. Spoel de cellen met steriele PBS om alle sporen van het medium te verwijderen.Voeg drie milliliter steriele trypsine EDTA toe aan de kolf en broed het drie tot vijf minuten in op 37 graden Celsius. Observeer de kolf onder de microscoop om de voortgang van enzymatische spijsvertering te volgen. Wanneer ongeveer 80% van de cellen worden opgeschort, voeg zes tot acht milliliter groeimedium toe aan de kolf.Verzamel de cellen door zachtjes te pipetten en breng ze over naar een 15 milliliter steriele buis. Centrifuge de buis op 135 keer G gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de HeLa cellen in drie milliliter van volledige groei medium.Na het tweemaal herhalen van de wasstappen, de cellen opnieuw opsuspenen in één milliliter van volledig groeimedium. Tel vervolgens de cellen onder de microscoop met behulp van een hemocytometer. Na het centrifugeren van de cellen opnieuw, verwijder de supernatant.Resuspend de cellen in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis bij een concentratie van vijf keer 10 tot de zevende cellen per milliliter. Houd de cellen warm door de buis in één hand te houden bij het transport naar de visfaciliteit. Plaats met behulp van een plastic pipet de embryo's van zebravissen op de injectieplaat.Leg embryo's op hun zijkanten met het voorste naar voren gericht op de groeven op de plaat. Zet de luchtbron en de micro-injector aan. Na het ophalen van de HeLa cellen uit de incubator, pipette de cellen op en neer 20 tot 30 keer met behulp van een P200.Met behulp van een gel laadpunt met een gesneden uiteinde, onmiddellijk laden drie microliters van de HeLa cel suspensie in een van de injectienaalden. Steek de naald in de naaldhouder en plaats de injectieplaat onder de microscoop. Injecteer het celmengsel in het embryo op het gevasculariseerde gebied onder de perivitellineholte door op het voetpedaal te drukken.Dan pipette een paar druppels steriel viswater op het embryo. Om het injectieproces voort te zetten, gebruikt u de niet-dominante hand om de injectieplaat naar het volgende embryo te verplaatsen en vervolgens de dominante hand te gebruiken om de injector uit te breiden en in te trekken terwijl u tegelijkertijd op het voetpedaal drukt. Werk de injectie van alle embryo's op het bord af en was de embryo's met steriel viswater in een steriel petrischaaltje.Onmiddellijk incubeer de schotel op 35,5 graden Celsius. Na drie uur, onderzoek de geïnjecteerde embryo's en verwijder de dode. Maak de volgende dag injectienaalden voor de nanodeeltjes en bewaar ze op stopverf in een grote petrischaal.Werken onder een fluorescerende microscoop, zorgvuldig pick-up embryo's met staart uitzaaiingen en leg ze op een nieuwe injectieplaat met steriel viswater. Voor elke zebravis met een staartmetastase, injecteer ofwel nano-deeltje oplossing of water achter het oog. Injecteer ook nanodeeltjesoplossing achter de ogen van de zebravis in de controlegroep die geen HeLa-transplantaties heeft ondergaan en alle geïnjecteerde embryo's bij 35,5 graden Celsius heeft geïncubeerd.Onmiddellijk na de injectie en opnieuw met intervallen van 30 tot 60 minuten, breng twee tot drie embryo's naar een petrischaaltje en immobiliseer ze door vijf druppels verdunde MS222-oplossing toe te voegen. Zodra de embryo's stoppen met zwemmen, verwijder het grootste deel van het water om de embryo's te laten liggen op hun zijkanten. Met behulp van een pipet met een dunne zachte borstel bevestigd aan het einde, lijn de embryo's, zodat ze liggen met de voorste naar voren en slechts een oog zichtbaar.Met behulp van 2x vergroting, leg beelden van het hele embryo op rode, blauwe en Brightfield kanalen. Om het staartgebied vast te leggen, beeldt u de embryo's bij 6,4x vergroting. Focus het embryo onder het rode kanaal om het bloeden van nanodeeltjes te voorkomen.Voeg onmiddellijk na beeldvorming vers viswater toe aan de embryo's en breng ze terug naar de couveuse. Geïnjecteerd en controle zebravis embryo's werden afgebeeld met behulp van een fluorescerende microscoop. De rode stippen zijn uitgezaaide menselijke baarmoederhalskankercellen, terwijl de blauwe stippen de nanodeeltjes vertegenwoordigen.In één controlegroep waren zebravissen die werden geïnjecteerd met kankercellen, maar niet met nanodeeltjes, fluorescerende HeLa-cellen zichtbaar in het rode kanaal en werden er geen specifieke fluorescerende signalen gedetecteerd in het blauwe kanaal. In de andere controlegroep werden zebravissen geïnjecteerd met nanodeeltjes, maar niet met kankercellen. Blauwe fluorescerende nanodeeltjes werden verspreid over de bloedsomloop.Er was geen specifieke rode bloeiwijze zichtbaar. Wanneer zebravissen met staartmetastasen werden geïnjecteerd met nanodeeltjes, tonen bedekte beelden van de rode en blauwe kanalen co-lokalisatie van HeLa-cellen en nanodeeltjes. Na het uitvoeren van deze methode, kunnen we analyseren tumorlast en kankercel overleving, de dieren met en zonder injecteren nano-deeltjes om hun vermogen van het doden van kankercellen aan te passen.Deze techniek kan de selectie van het optimale nanodeeltje vergemakkelijken dat specifiek de kankercel in vivo kan herkennen, wat leidt tot vroegtijdige opsporing van kanker en kankermetastase.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A plCSA-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthese en karakterisering van placenta Chondroitin sulfaat een (plCSA) - Targeting lipide - polymeer nanodeeltjes

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemische conjugatie van een gezuiverd DEC-205-gericht antilichaam met eiwit over de volledige lengte voor het richten van dendritische cellen van muizen in vitro en in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Fluorescentiemicroscopie voor ATP-internalisatie gemedieerd door macropinocytose in menselijke tumorcellen en tumor-xenogetransplanteerde muizen

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...