Name: in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

Gli autori ringraziano la signora Kaylee Smith, la signora Lauren Kwok e il signor Alexander Floru per aver corretto il manoscritto. H.F. riconosce il sostegno della NIH (CA134743 e CA215059), dell'American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) e della St. Baldrick's Foundation. F.J.F.L. riconosce una borsa di studio presso il Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S riconosce il supporto NSF (grant CBET 1605405) e NIH R41AI142890.

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Boston University School of Medicine nell'ambito del protocollo: PROTO201800543.
1. Generazione di embrioni di pesce zebra Casper
<ol><li>Scegli pesci Casper adulti di almeno 3 mesi di età per l'allevamento naturale per generare embrioni trasparenti di pesce zebra Casper.</li>
	<li>Riempire le vasche di accoppiamento a due camere con acqua d...

<ol>
	<li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer.">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li><li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer.">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li><li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers,+Cells,+and+Tissues+by+Fluorescence.">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li><li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer.">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li><li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models:+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes.">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li><li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research.">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases.">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis.">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li><li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish.">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hela+Cells:+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle.">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li></ol>

Il protocollo qui descritto utilizza il pesce zebra come un sistema in vivo per testare la capacità delle nanoparticelle di riconoscere e colpire le cellule tumorali umane metastatiche. Diversi fattori possono influire sul successo dell'esecuzione degli esperimenti. In primo luogo, gli embrioni devono essere completamente sviluppati a 48 hpf. La corretta fase di sviluppo degli embrioni consente loro di sopportare e sopravvivere al trapianto di cellule tumorali umane. Gli embrioni di età inferiore a 48 hpf hanno un tass...

Lo sviluppo di nanoparticelle in grado di rilevare, colpire e distruggere le cellule tumorali è di grande interesse sia per i fisici che per i ricercatori biomedici. L'emergere della nanomedicina ha portato allo sviluppo di diverse nanoparticelle, come quelle coniugate con ligande bersaglio e/o farmaci chemioterapici1,2,3. Le proprietà aggiunte delle nanoparticelle consentono la loro interazione con il sistema biologico, rilevando e monitorando gli eventi biologici con alta efficienza e precisione insieme ad applicazioni terapeutiche. Le nanoparticelle di oro e ossido di ferro sono utilizzate principalmente nelle applicazioni di tomografia computerizzata e risonanza magnetica, rispettivamente. Mentre le attività enzimatiche delle nanoparticelle di oro e ossido di ferro consentono di rilevare le cellule tumorali attraverso saggi colorimetrici, le nanoparticelle fluorescenti sono adatte per le applicazioni di imaging in vivo4. Tra queste, le nanoparticelle fluorescenti ultrabro sono particolarmente utili, a causa della loro capacità di rilevare precocemente i tumori con meno particelle e meno tossicità5.
Nonostante questi vantaggi, le nanoparticelle richiedono la sperimentazione utilizzando modelli animali in vivo per la selezione di nanomateriali adatti e l'ottimizzazione del processo di sintesi. Inoltre, proprio come i farmaci, le nanoparticelle si basano su modelli animali per test preclinici per determinarne l'efficacia e le tossicità. Il modello preclinico più utilizzato è il topo, che è un mammifero la cui manutenzione ha un costo relativamente elevato. Per gli studi sul cancro, topi geneticamente modificati o topi xenopianti sono in genereutilizzati 6,7. La durata di questi esperimenti spesso si estende da settimane a mesi. In particolare, per gli studi sulla metastasi del cancro, le cellule tumorali vengono iniettate direttamente nel sistema circolatorio dei topi in luoghi come le vene della coda e le milza8,9,10. Questi modelli rappresentano solo le fasi finali della metastasi quando le cellule tumorali stravasano e colonizzano organi distanti. Inoltre, a causa di problemi di visibilità, è particolarmente difficile monitorare la migrazione delle cellule tumorali e il targeting delle nanoparticelle delle cellule tumorali nei topi.
Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un potente sistema di vertebrati per la ricerca sul cancro a causa della sua elevata fecondità, basso costo, rapido sviluppo, trasparenza ottica e conservazione genetica11,12. Un altro vantaggio del pesce zebra rispetto al modello murino è la fecondazione delle uova di pesce ex utero, che consente agli embrioni di essere monitorati durante il loro sviluppo. Lo sviluppo embrionale è rapido nel pesce zebra, e nel giro di 24 ore postfertilizzazione (hpf), il piano del corpo vertebrato ha giàformato 13. Con 72 hpf, le uova vengono schiuse dal chorion, passando dallo stadio embrionale a quello della frittura. La trasparenza del pesce zebra, il ceppo Casper in particolare14, offre un'opportunità unica per visualizzare la migrazione delle cellule tumorali e il loro riconoscimento e targeting da parte di nanoparticelle in un animale vivente. Infine, i pesci zebra sviluppano il loro sistema immunitario innato di 48 hpf, con il sistema immunitario adattivo in ritardo e diventando funzionale solo a 28 giorni di postferilizzazione15. Questo lasso di tempo è ideale per il trapianto di vari tipi di cellule tumorali umane in embrioni di pesce zebra senza sperimentare rifiuti immunitari.
Descritto qui è un metodo che sfrutta la trasparenza e il rapido sviluppo del pesce zebra per dimostrare il riconoscimento e il targeting delle cellule tumorali umane da nanoparticelle fluorescenti in vivo. In questo saggio, le cellule tumorali cervicali umane (cellule HeLa) geneticamente progettate per esprimere una proteina fluorescente rossa sono state iniettate nell'area vascolarizzata nella cavità perivitellina di embrioni da 48 hpf. Dopo 20-24 h, le cellule HeLa si erano già diffuse in tutti gli embrioni attraverso il sistema circolatorio dei pesci. Gli embrioni con metastasi apparente sono stati microiniettati con 0,5 nL di una soluzione di nanoparticelle direttamente dietro l'occhio, dove si trova il ricco letto capillare. Utilizzando questa tecnica, le nanoparticelle di silice fluorescenti ultra-abrasa possono colpire le cellule HeLa con una velocità di 20-30 min di postiniezione. Grazie alla sua semplicità ed efficacia, il pesce zebra rappresenta un robusto modello in vivo per testare una varietà di nanoparticelle per la loro capacità di colpire specifiche cellule tumorali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer and monitor</td>
			<td>ThinkCentre</td>
			<td>X000335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35960-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MMPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX-10 fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 tip</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SB93102</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>50-998-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYSPV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche-Sigma-Fisher</td>
			<td>50-100-3275</td>
			<td>Roche product made by Sigma- sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ51 dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Western Chemicals</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish

Lo sviluppo di nanoparticelle in grado di rilevare, colpire e distruggere le cellule tumorali è di grande interesse nel campo della nanomedicina. I modelli animali in vivo sono necessari per colmare la nanotecnologia con la sua applicazione biomedica. Il topo rappresenta il modello animale tradizionale per la prova preclinica; tuttavia, i topi sono relativamente costosi da mantenere e hanno lunghi cicli sperimentali a causa della progenie limitata da ogni madre. Il pesce zebra è emerso come un potente sistema modello per la ricerca sullo sviluppo e biomedica, compresa la ricerca sul cancro. In particolare, grazie alla sua trasparenza ottica e al rapido sviluppo, gli embrioni di pesce zebra sono adatti per il monitoraggio in tempo reale in vivo del comportamento delle cellule tumorali e delle loro interazioni con il loro microambiente. Questo metodo è stato sviluppato per introdurre in sequenza le cellule tumorali umane e le nanoparticelle funzionalizzate negli embrioni trasparenti di pesce zebra Casper e monitorare il riconoscimento in vivo e il targeting delle cellule tumorali da parte delle nanoparticelle in tempo reale. Questo protocollo ottimizzato mostra che le nanoparticelle etichettate in fluorescenza, che sono funzionalizzate con gruppi di folati, possono riconoscere e colpire specificamente le cellule tumorali epiteliali cervicali umane metastatiche etichettate con un'altra fluorochroma. Il processo di riconoscimento e targeting può avvenire già 30 minuti postinizione delle nanoparticelle testate. L'intero esperimento richiede solo l'allevamento di poche coppie di pesci adulti e richiede meno di 4 giorni per essere completato. Inoltre, gli embrioni di pesce zebra non dispongono di un sistema immunitario adattivo funzionale, che consente l'innesto di una vasta gamma di cellule tumorali umane. Pertanto, l'utilità del protocollo qui descritto consente il test di nanoparticelle su vari tipi di cellule tumorali umane, facilitando la selezione di nanoparticelle ottimali in ogni contesto di cancro specifico per i futuri test nei mammiferi e nella clinica.

Lo schema del protocollo illustrato nella Figura 1 illustra le procedure generali per questo studio. Sono stati allevati pesci adulti maschi e femmine trasparenti Casper per generare embrioni (sezione 1). Le cellule di HeLa di RFP sono state iniettate nell'area vascolarizzata sotto la cavità pervitellina degli embrioni di pesce zebra a 48 hpf, con embrioni non iniettati come controlli (sezione 3). Per gli individui con esperienza nella microiniezion...

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In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Descritto qui è un metodo per utilizzare gli embrioni di pesce zebra per studiare la capacità delle nanoparticelle funzionalizzate di colpire le cellule tumorali umane in vivo. Questo metodo consente la valutazione e la selezione di nanoparticelle ottimali per test futuri su animali di grandi dimensioni e in studi clinici.

In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Questa procedura consente ai ricercatori di valutare e selezionare nanoparticelle ottimali per studi su animali di grandi dimensioni e studi clinici. Questo semplice metodo aiuta a determinare se la nanoparticella può colpire le cellule tumorali umane in vivo e, in tal caso, quanto è efficiente il targeting. A dimostrare le procedure saranno il Dr.Xiodan Qin, un postdoc, e il Signor Andrew Lam, un tecnico di ricerca del nostro laboratorio.Riempire due vasche di accoppiamento a camera con acqua di pesce la sera e separare i serbatoi superiori utilizzando divisori. Posizionare un pesce zebra maschio in un lato della camera e una o due femmine di zebrafish in un altro lato della camera. Rimuovere i divisori alle 8:00 del mattino seguente.Aggiungere piante di arricchimento artificiali e inclinare leggermente la camera superiore per creare un'area d'acqua poco profonda. Lasciare che il pesce zebra si riprodu per tre o quattro ore e raccogliere le uova dalla camera inferiore versando l'acqua attraverso una rete a rete. Trasferire le uova in una piastra di Petri con non più di 200 uova per piatto.Rimuovere eventuali uova morte o non fecondate. Riempire il piatto due terzi pieno di acqua di pesce fresco e posizionare nell'incubatrice. Dopo 24 ore, rimuovere il piatto dall'incubatrice e rimuovere quanta più acqua possibile dal piatto.Aggiungere alcune gocce di un milligrammo per millilitro pronasi soluzione e ruotare delicatamente il piatto. Quando i corrioni mostrano segni di disintegrazione, pipettare gli embrioni su e giù alcune volte per abbattere i coriorioni e rilasciare gli embrioni. Una volta che la maggior parte degli embrioni è fuori dai corioni, aggiungere immediatamente acqua di pesce fresco per terminare il processo.Risciacquare gli embrioni con acqua di pesce tre volte per rimuovere i coriaci galleggianti Restituire gli embrioni all'incubatrice. Crea una soluzione di agarosio al 3% aggiungendo tre grammi di agarosio di grado elettroforesi a 100 millilitri di acqua di pesce autoclavata. Microonde l'agarosio e l'acqua fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.Per creare la piastra di iniezione, versare la soluzione di agarosio caldo in una piastra di Petri fino a quando non è piena di tre quarti e posizionare lo stampo a micro iniezione sull'agarosio. Dopo che l'agarosio si è solidificato, rimuovere con cura lo stampo. Riempire la piastra di iniezione risultante con acqua di pesce autoclavata e conservarla a quattro gradi Celsius.Per realizzare gli aghi di iniezione, tirare i capillari di vetro borosilicato di un millimetro di diametro esterno di 0,78 millimetri su un estrattore di pipetta. Conservare gli aghi di iniezione su uno stito in una grande piastra di Petri che è stata asciugata con un asciugamano di etanolo. Prima di raccogliere le cellule HeLa, riventare la piastra di iniezione e l'acqua di pesce nell'incubatrice a 35,5 gradi Celsius.30 minuti a un'ora prima del trapianto, raccogliere le cellule HeLa. Lavorando in una cappa di coltura tissutale, rimuovere il mezzo dal pallone per aspirazione. Risciacquare le cellule con PBS sterile per rimuovere tutte le tracce del mezzo.Aggiungere tre millilitri di EDTA sterile di tripina al pallone e incubarlo a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti. Osservare il pallone al microscopio per monitorare l'avanzamento della digestione enzimatica. Quando circa l'80% delle cellule è sospeso, aggiungere da sei a otto millilitri di mezzo di crescita al pallone.Raccogliere le cellule tubazioni delicatamente e trasferirle in un tubo sterile da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 135 volte G per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule HeLa in tre millilitri di mezzo di crescita completo.Dopo aver ripetuto due volte i passaggi di lavaggio, rimorsi le cellule in un millilitro di mezzo di crescita completo. Quindi contare le cellule al microscopio usando un emocitometro. Dopo aver centrifugato di nuovo le cellule, rimuovere il supernatante.Rimescolare le cellule in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri ad una concentrazione di cinque volte 10 alla settima cellule per millilitro. Mantenere le celle calde tenendo il tubo in una mano durante il trasporto verso l'impianto di pesca. Utilizzando una pipetta di plastica, posizionare gli embrioni di zebrafish sulla piastra di iniezione.Posare gli embrioni sui loro lati con la parte anteriore rivolta in avanti allineata alle scanalature sul piatto. Accendere la fonte d'aria e il micro iniettore. Dopo aver recuperato le cellule HeLa dall'incubatore, pipettare le cellule su e giù da 20 a 30 volte usando un P200.Utilizzando una punta di caricamento del gel con un'estremità tagliata, caricare immediatamente tre microlitri della sospensione cellulare HeLa in uno degli aghi di iniezione. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e posizionare la piastra di iniezione al microscopio. Iniettare la miscela cellulare nell'embrione nell'area vascolarizzata sotto la cavità perivitellina premendo il pedale del piede.Quindi pipettare alcune gocce di acqua di pesce sterile sull'embrione. Per continuare il processo di iniezione, utilizzare la mano non dominante per spostare la piastra di iniezione sull'embrione successivo, quindi utilizzare la mano dominante per estendere e ritrarre l'iniettore premendo contemporaneamente il pedale del piede. Termina l'iniezione di tutti gli embrioni sul piatto e lava gli embrioni con acqua di pesce sterile in una piastra di Petri sterile.Incubare immediatamente il piatto a 35,5 gradi Celsius. Dopo tre ore, esaminare gli embrioni iniettati e rimuovere quelli morti. Il giorno dopo, fai aghi di iniezione per le nanoparticelle e conservali su uno putty in una grande piastra di Petri.Lavorando al microscopio fluorescente, raccogli attentamente gli embrioni con metastasi della coda e posizionali su una nuova piastra di iniezione con acqua di pesce sterile. Per ogni zebrafish con metastasi della coda, iniettare soluzione di nanoparticelle o acqua dietro l'occhio. Iniettare anche una soluzione di nanoparticelle dietro gli occhi del pesce zebra nel gruppo di controllo che non ha ricevuto trapianti di HeLa e incubare tutti gli embrioni iniettati a 35,5 gradi Celsius.Immediatamente dopo l'iniezione e di nuovo a intervalli da 30 a 60 minuti, trasferire da due a tre embrioni in una piastra di Petri e immobilizzarli aggiungendo cinque gocce di soluzione MS222 diluita. Una volta che gli embrioni smettono di nuotare, rimuovere la maggior parte dell'acqua per consentire agli embrioni di sdraiarsi sui loro lati. Utilizzando una pipetta con un sottile pennello morbido attaccato alla sua estremità, allineare gli embrioni in modo che giacciono con la parte anteriore rivolta in avanti e solo un occhio visibile.Utilizzando l'ingrandimento 2X, cattura le immagini dell'intero embrione sui canali rosso, blu e Brightfield. Per catturare l'area della coda, immagini gli embrioni con ingrandimento 6.4X. Focalizzare l'embrione sotto il canale rosso per evitare il sanguinamento delle nanoparticelle.Immediatamente dopo l'imaging, aggiungere acqua di pesce fresco agli embrioni e restituirli all'incubatrice. Gli embrioni zebrafish iniettati e di controllo sono stati coniati utilizzando un microscopio fluorescente. I punti rossi sono cellule tumorali cervicali umane metastatiche mentre i punti blu rappresentano le nanoparticelle.In un gruppo di controllo, i pesci zebra che sono stati iniettati con cellule tumorali ma non nanoparticelle, le cellule HeLa fluorescenti erano visibili nel canale rosso e non sono stati rilevati segnali fluorescenti specifici nel canale blu. Nell'altro gruppo di controllo, ai pesci zebra sono state iniettate nanoparticelle, ma non con cellule tumorali. Le nanoparticelle fluorescenti blu sono state distribuite in tutto il sistema circolatorio.Nessuna florescence rossa specifica era visibile. Quando i pesci zebra con metastasi della coda sono stati iniettati con nanoparticelle, le immagini sovrapposte dai canali rosso e blu mostrano la co-localizzazione delle cellule HeLa e delle nanoparticelle. Dopo aver eseguito questo metodo, possiamo analizzare il peso del tumore e la sopravvivenza delle cellule tumorali, gli animali con e senza iniettare nanoparticelle per regolare la loro capacità di uccidere le cellule tumorali.Questa tecnica può facilitare la selezione della nanoparticella ottimale in grado di riconoscere specificamente la cellula tumorale in vivo portando alla diagnosi precoce di cancro e metastasi tumorale.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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