Name: in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

저자들은 케일리 스미스 양, 로렌 곽 씨, 그리고 원고를 교정한 알렉산더 플로루씨에게 감사를 표합니다. H.F.는 NIH(CA134743 및 CA215059), 미국 암 학회(RSG-17-204 01-TBG), 세인트 볼드릭 재단의 보조금 지원을 인정합니다. F.J.F.L.은 보스턴 대학 혁신 센터-부나노 암용 나노 기술 (XTNC)의 교차 징계 교육에서 펠로우십을 인정합니다. I.S는 NSF 지원(CBET 1605405) 및 NIH R41AI142890을 인정합니다.

모든 동물 절차는 프로토콜 #: PROTO201800543에 따라 보스턴 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 캐스퍼 제브라피쉬 배아 생성
<ol><li>투명한 캐스퍼 제브라피시 배아를 생성하기 위해 자연 사육을 위해 적어도 3 개월 의 성인 캐스퍼 물고기를 선택하십시오.</li>
	<li>저녁에 물고기 물로 두 챔버 짝짓기 탱크를 채?...

<ol>
	<li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer.">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li><li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer.">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li><li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers,+Cells,+and+Tissues+by+Fluorescence.">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li><li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer.">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li><li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models:+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes.">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li><li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research.">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases.">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis.">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li><li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish.">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hela+Cells:+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle.">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li></ol>

여기서 설명된 프로토콜은 나노입자가 전이성 인간 암세포를 인식하고 표적으로 하는 능력을 시험하기 위해 생체 내 시스템으로 제브라피쉬를 활용한다. 실험의 성공적인 실행에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 첫째, 배아는 48hpf에서 완전히 개발되어야 합니다. 배아의 올바른 발달 단계는 인간 적인 암세포의 이식을 견디고 살아남을 수 있게 합니다. 48 hpf 미만의 배아는 더 오래?...

암세포를 검출, 표적화 및 파괴할 수 있는 나노입자의 개발은 물리학자와 생물의학 연구자 모두에게 큰 관심사입니다. 나노의학의 출현은 리간드 및/또는 화학요법 약물1,,2,,3을표적으로 하는 것과 같은 여러 나노입자의 개발로 이어졌다. 나노 입자의 추가 특성은 치료 응용 프로그램과 함께 고효율 및 정확도로 생물학적 사건을 감지하고 모니터링하면서 생물학적 시스템과의 상호 작용을 가능하게합니다. 금과 산화철 나노입자는 주로 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 이미징 응용 분야에서 각각 사용됩니다. 금과 산화철 나노입자의 효소 활동은 착색 분석법을 통해 암세포의 검출을 허용하지만, 형광 나노입자는 생체 내 이미징 응용 4에적합합니다. 그 중에서도 초브라이트 형광 나노 입자는 입자가 적고 독성이 감소하여 암을 조기에 검출할 수 있기 때문에 특히 유용합니다5.
이러한 장점에도 불구하고, 나노 입자는 적절한 나노 물질 및 합성 공정의 최적화를 위해 생체 내 동물 모델을 사용하여 실험을 필요로 한다. 또한 약물과 마찬가지로 나노 입자는 전임상 테스트를 위해 동물 모델에 의존하여 효능과 독성을 결정합니다. 가장 널리 사용되는 전임상 모델은 마우스로, 이는 상대적으로 높은 비용으로 유지보수가 오는 포유류입니다. 암 연구를 위해, 유전자 조작된 마우스 또는 이노이식 마우스는 전형적으로6,7를7이용한다. 이 실험의 길이는 수시로 주에서 달에 걸쳐 있습니다. 특히, 암 전이 연구를 위해, 암세포는 꼬리 정맥 및 비장8,,9,,10과 같은 위치에서 마우스의 순환 시스템에 직접 주입된다. 이 모형은 종양 세포가 멀리 있는 기관을 사치화하고 식민지화할 때 전이의 끝 단계를 나타냅니다. 더욱이, 가시성 문제로 인해, 마우스에 있는 종양 세포의 종양 세포 이동 및 나노 입자 표적을 감시하는 것은 특히 도전적입니다.
제브라피쉬(Daniorerio)는높은 균류, 저비용, 신속한 발달, 광학 투명성 및 유전적보존(11,,12)으로인해 암 연구를 위한 강력한 척추동물 시스템이 되었다. 마우스 모델에 비해 zebrafish의 또 다른 장점은 물고기 계란 ex utero의 수정으로, 이는 배아가 그들의 발달 내내 감시될 수 있게 합니다. 배아 발달은 얼룩말에서 급속하고, 24 시간 이내에 후유증 (hpf), 척추 동물 바디 플레인은 이미형성했다 13. 72 hpf에 의해, 계란은 초리온에서 부화되어 배아에서 튀김 단계로 전환됩니다. 특히14개의제브라피쉬균의 투명성은 암세포의 이주와 살아있는 동물의 나노입자에 의한 인식과 표적화를 시각화할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. Casper 마지막으로, 제브라피쉬는 48hpf로 타고난 면역체계를 개발하며 적응형 면역체계가 뒤쳐지고 28일 후유분화15일에만기능성으로 변한다. 이 시간 간격은 면역 거부를 경험하지 않고 제브라피시 배아로 인간 암세포의 각종 모형의 이식에 이상적입니다.
여기서 설명된 방법은 제브라피쉬의 투명성과 신속한 발달을 활용하여 생체내형 나노입자에 의한 인간 암세포의 인식 및 표적화를 입증하는 방법이다. 이 분석에서, 적색 형광 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 인간 자궁경부암세포(HeLa 세포)는 48hpf 배아의 생체내내혈관내로 주입되었다. 20-24 시간 후에, HeLa 세포는 이미 물고기 순환 계통을 통해 배아를 통해 퍼졌습니다. 명백한 전이를 가진 태아는 부유한 모세관 침대가 있는 눈 의 뒤에 나노 입자 용액의 ~0.5 nL로 마이크로인주사되었습니다. 이 기술을 사용하여, 초브라이트 형광 실리카 나노 입자는 20-30 분 사후 주입으로 빨리 HeLa 세포를 표적으로 할 수 있습니다. 그 단순성과 효과 로 인해, 제브라피쉬는 특정 암세포를 표적으로 하는 그들의 능력을 위해 다양한 나노 입자를 시험하는 강력한 생체 내 모형을 나타냅니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer and monitor</td>
			<td>ThinkCentre</td>
			<td>X000335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35960-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MMPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX-10 fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 tip</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SB93102</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>50-998-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYSPV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche-Sigma-Fisher</td>
			<td>50-100-3275</td>
			<td>Roche product made by Sigma- sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ51 dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Western Chemicals</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish

암세포를 검출, 표적화 및 파괴할 수 있는 나노입자를 개발하는 것은 나노의학 분야에 큰 관심을 가지고 있습니다. 생체 내 동물 모델은 나노 기술을 생체 의학 응용 분야에 연결하는 데 필요합니다. 마우스는 전임상 테스트를 위한 전통적인 동물 모델을 나타낸다; 그러나, 마우스는 각 어머니에게서 제한된 자손 때문에 오래 실험 주기를 유지하고 지키기 위하여 상대적으로 비쌉니다. 제브라피쉬는 암 연구를 포함한 발달 및 생물 의학 연구를 위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히, 그 광학 투명성과 급속한 발달로 인해, 제브라피쉬 배아는 암세포의 행동과 그들의 마이크로 환경과의 상호 작용의 생체 내 모니터링에 실시간으로 적합합니다. 이 방법은 투명한 캐스퍼 제브라피시 배아에서 인간 암세포와 기능성 나노입자를 순차적으로 도입하고 나노입자에 의한 암세포의 생체 인식 및 표적화를 실시간으로 모니터링하기 위해 개발되었다. 이 최적화된 프로토콜은 엽산기 그룹으로 기능화되는 형광으로 표지된 나노입자가 다른 형광크롬으로 표지된 전이성 인간 자궁경부 상피암세포를 구체적으로 인식하고 표적으로 삼을 수 있음을 보여준다. 인식 및 표적화 공정은 테스트된 나노입자의 30분 후 사출이 조기에 발생할 수 있다. 전체 실험은 성인 물고기의 몇 쌍의 번식을 필요로하고 완료하는 데 4 일 미만걸립니다. 더욱이, 제브라피시 배아는 기능적인 적응성 면역 계통이 부족하여 광범위한 인간 암세포를 이식할 수 있습니다. 따라서, 여기에 설명된 프로토콜의 유용성은 포유류와 클리닉에서 향후 검사를 위해 각 특정 암 맥락에서 최적의 나노 입자의 선택을 용이하게하는 다양한 유형의 인간 암세포에 대한 나노 입자의 테스트를 가능하게 한다.

그림 1의 프로토콜 회로도는 이 연구의 전반적인 절차를 보여줍니다. 투명한 캐스퍼 남성과 여성 성인 물고기는 배아를 생성하기 위해 사육되었다 (섹션 1). RFP+ HeLa 세포는 48hpf에서 제브라피시 배아의 각막 아래 혈관 으로 주입된 부위에 주입되었고, 비주입된 배아는 대조군(섹션 3)으로 주입되었다. 미세 주입경험이 있는 개인의 경우, 배아의 ...

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In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

여기에 설명된 제브라피쉬 배아를 활용하여 생체내에서 인간 암세포를 표적으로 하는 기능성 나노입자의 능력을 연구하는 방법이다. 이 방법을 통해 대규모 동물 및 임상 시험에서 향후 테스트를 위한 최적의 나노입자의 평가 및 선택을 가능하게 합니다.

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

이 절차는 연구원이 큰 동물 및 임상 시험에서 연구를 위한 최적 나노 입자를 평가하고 선택할 수 있게 합니다. 이 간단한 방법은 나노 입자가 생체 내에서 인간 암세포를 표적으로 할 수 있는지 여부와 그렇다면 타겟팅이 얼마나 효율적인지 결정하는 데 도움이됩니다. 절차를 시연하는 것은 포스트닥인 Xiodan Qin 박사와 실험실의 연구 기술자인 앤드류 램(Andrew Lam) 씨가 될 것입니다.저녁에 물고기 물로 두 챔버 짝짓기 탱크를 채우고 칸막이를 사용하여 상부 탱크를 분리합니다. 수컷 얼룩말물고기를 챔버의 한쪽에 놓고 한두 마리의 암컷 얼룩말물고기를 챔버의 다른 쪽에 놓습니다. 다음날 아침 8:00에 칸막이를 제거하십시오.인공 농축 식물을 추가하고 물 얕은 영역을 만들기 위해 상단 챔버를 약간 기울입니다. 제브라피쉬가 3~4시간 동안 번식하고 메쉬 그물을 통해 물을 부어 아래방에서 알을 모을 수 있도록 한다. 계란을 접시당 200개 이하의 달걀과 함께 페트리 요리로 옮기습니다.죽은 또는 수정되지 않은 계란을 제거합니다. 신선한 생선 물로 가득 찬 요리 의 3 분의 2를 채우고 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 후 인큐베이터에서 접시를 제거하고 접시에서 가능한 한 많은 물을 제거합니다.밀리리터 pronase 용액 당 1 밀리그램 을 몇 방울 더 넣고 부드럽게 접시를 소용돌이. chorions가 붕괴의 표시를 보일 때, 배아를 위아래로 몇 번 피펫하여 축을 분해하고 배아를 방출합니다. 배아의 대부분이 축축해지면 즉시 신선한 생선물을 추가하여 과정을 종료합니다.물고기 물로 배아를 세 번 헹구면 부동 축고를 제거하여 배아를 인큐베이터로 돌려보도록 한다. 3%의 아가로즈 용액을 3그램의 전기전도급 아가로즈를 100밀리리터에 첨가하여 100밀리리터의 오토클레이브 어수질을 추가하십시오. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 아가로즈와 물을 전자레인지에 담그고 있습니다.사출판을 만들려면 뜨거운 아가로즈 용액을 페트리 접시에 붓고 3쿼터가 가득 차서 아가로즈에 마이크로 사출 몰드를 놓습니다. 아가로즈가 고화된 후, 조심스럽게 금형을 제거합니다. 그 결과 주입판을 오토클레이브 생선물로 채우고 섭씨 4도에 보관하십시오.주입 바늘을 만들려면, 보로실리케이트 유리 모세혈관을 파이펫 풀러에 0.78 밀리미터로 1밀리미터 외부 직경을 당깁니다. 에탄올 타월로 닦아 버린 큰 페트리 접시에 퍼티에 주사 바늘을 보관하십시오. HeLa 세포를 수확하기 전에 인큐베이터에서 주입 판과 생선물을 섭씨 35.5도에서 다시 데우습니다.이식 하기 전에 30 분에서 1 시간, HeLa 세포를 수확. 조직 배양 후드에서 작업, 포부에 의해 플라스크에서 매체를 제거. 멸균 PBS로 세포를 헹구어 배지의 모든 흔적을 제거합니다.플라스크에 멸균 트립신 EDTA 3 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 3~5분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 플라스크를 관찰하여 효소 소화의 진행 상황을 모니터링합니다. 세포의 약 80%가 일시 중단되면 플라스크에 6~8밀리리터의 성장 배지를 추가합니다.부드럽게 파이펫으로 세포를 수집하고 15 밀리리터 멸균 튜브로 전송합니다. 5 분 동안 135 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 슈퍼나탈자를 흡인시키고 완전한 성장 배지의 3밀리리터에서 HeLa 세포를 재보중단한다.세척 단계를 두 번 반복 한 후 완전한 성장 매체의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 혈종계를 사용하여 현미경으로 세포를 계산합니다. 세포를 다시 원심 분리한 후 상체를 제거합니다.밀리리터당 7세포에 대해 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브의 세포를 5회 10회 농도로 재보페한다. 물고기 시설로 운반 할 때 한 손에 튜브를 잡고 세포를 따뜻하게 유지합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 제브라피시 배아를 사출 판에 놓습니다.전방을 향한 전방이 플레이트의 홈에 정렬되어 측면에 배아를 놓습니다. 공기 소스와 마이크로 인젝터를 켭니다. 인큐베이터에서 HeLa 세포를 검색한 후 P200을 사용하여 세포를 20~30회 위아래로 피펫합니다.절단 끝이있는 젤 로딩 팁을 사용하여 즉시 HeLa 세포 서스펜션의 3 마이크로 리터를 주입 바늘 중 하나에 로드합니다. 바늘을 바늘 홀더에 삽입하고 현미경 아래에 주사 판을 놓습니다. 발 페달을 눌러 각성 충치 아래 혈관 이내의 배아에 세포 혼합물을 주입한다.그런 다음 배아에 멸균 생선 물 몇 방울을 피펫. 주입 과정을 계속하려면, 비 지배적 인 손을 사용하여 사출 판을 다음 배아로 이동한 다음 지배적 인 손을 사용하여 발 페달을 동시에 누르는 동안 인젝터를 확장하고 철회하십시오. 접시에 있는 모든 배아의 주입을 완료하고 멸균 생선물로 배아를 멸균 페트리 접시에 넣습니다.즉시 섭씨 35.5도에서 접시를 배양합니다. 3 시간 후에 주입 된 배아를 검사하고 죽은 배아를 제거하십시오. 다음 날, 나노 입자에 대한 주입 바늘을 만들고 큰 페트리 접시에 퍼티에 저장합니다.형광 현미경으로 작업, 조심스럽게 꼬리 전이와 배아를 데리러 멸균 물고기 물새로운 주사 판에 배치. 꼬리 전이가 있는 각 얼룩말물고기에 대해 나노 입자 용액또는 눈 뒤에 물을 주입하십시오. 또한 HeLa 이식을 받지 못한 대조군에서 제브라피시의 눈 뒤에 나노 입자 용액을 주입하고 주입된 모든 배아를 섭씨 35.5도에서 배양한다.주입 직후 30~60분 간격으로 2~3개의 배아를 페트리 접시에 옮기고 희석된 MS222 용액 5방울을 추가하여 고정합니다. 배아가 수영을 중단하면 배아가 측면에 누워 있도록 대부분의 물을 제거하십시오. 끝에 얇은 부드러운 브러시가 부착된 파이펫을 사용하여 배아를 정렬하여 전방을 향하게 하고 한쪽 눈만 볼 수 있도록 합니다.2배 배율을 사용하여 빨간색, 파란색 및 브라이트필드 채널에서 전체 배아의 이미지를 캡처합니다. 꼬리 영역을 캡처하려면 배아를 6.4배 배율로 이미지화합니다. 나노 입자의 출혈을 피하기 위해 적색 채널 아래에 배아를 집중시킵니다.이미징 직후, 배아에 신선한 생선물을 넣고 인큐베이터로 돌려보라고 한다. 주입 및 제어 제브라피시 배아는 형광 현미경을 사용하여 이미지되었다. 적색점은 전이성 인간 자궁경부암세포이며, 청색점은 나노 입자를 나타낸다.한 대조군에서는, 암세포로 주입되었지만 나노 입자가 아닌 제브라피시, 형광 헬라 세포는 적색 채널에서 보였으며 특정 형광 신호는 청색 채널에서 검출되지 않았다. 다른 대조군에서는, 제브라피쉬는 나노 입자로 주입되었지만 암세포에서는 주입되지 않았다. 청색 형광 나노 입자는 순환 계통 전체에 분포하였다.구체적인 붉은 꽃집이 보이지 않았다. 꼬리 전이가 있는 제브라피쉬가 나노 입자로 주입되었을 때, 적색 및 파란색 채널의 오버레이 이미지는 HeLa 세포와 나노 입자의 공동 국소화를 보여줍니다. 이 방법을 수행한 후, 우리는 암세포를 죽이는 그들의 능력을 조정하기 위하여 나노 입자를 주입하는 안팎으로 종양 부담 및 암세포 생존, 동물을 분석할 수 있습니다.이 기술은 암과 암 전이의 조기 발견으로 이어지는 생체 내에서 암세포를 구체적으로 인식할 수 있는 최적의 나노입자의 선택을 용이하게 할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

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In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

연구

암 연구학

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인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

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Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

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생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

화학감수성 검사를 위한 췌장암의 Zebrafish 환자 유래 이종이식편 구축

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