Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

تم إنشاء بناء و المؤتلف الفيروس الأدينول للتعبير عن cytosol محددة roGFP في الخلايا في مختبر بول T. Schumacker, دكتوراه, فرايبرغ كلية الطب, جامعة نورث وسترن, وشركة ViraQuest, على التوالي. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل مركز دراسات الاستجابة المضيفة لعلاج السرطان منحة P20GM109005 من خلال المعهد الوطني للصحة مراكز العلوم الطبية العامة من التميز البحوث الطبية الحيوية (COBRE NIGMS)، المعهد الوطني لأنظمة العلوم الطبية العامة الصيدلة وبرنامج التدريب على السموم منحة T32 GM106999، UAMS مؤسسة / جائزة الوقف البحوث الطبية AWD00053956، UAMS في نهاية العام جوائز المستشار AWD00053484. تم دعم مرفق القلب الأساسي للتدفق من قبل مركز الإمراض الميكروبية ومضيف الاستجابات الالتهابية منحة P20GM103625 من خلال COBRE NIGMS. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لل المعاهد القومية للصحة. وقد تم دعم المساعدة من قبل مجلس البحوث العلمية والتكنولوجية في تركيا (TUBITAK) 2214-A المنح الدراسية.

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول ل 70% -80% التقاء خلايا MDA-MB-231. بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى، ينبغي إعادة تهيئة عدد الخلايا وتعدد العدوى (MOI).
1. إعداد الخلايا (اليوم 1)
<ol><li>الحفاظ على MDA-MB-231 خط الخلية في 75 سم2 قارورة مع 10 مل من المتوسط النسر المعدلة دولبيككو (DMEM) تكملها 10٪ مصل ?...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

يعكس توازن الثيول/ثاني كبريتيد في كائن حي حالة الأكسدة الحمراء للخلايا. الكائنات الحية لديها الجلوتاثيون، السيستين، thiols البروتين، وthols منخفضة الوزن الجزيئي، وكلها تتأثر بمستوى الأكسدة وتردي حالة الأكسدة من الخلايا4. 2006 2006 تسمح roGFPs المهندسة بالكم غير التخريبية لتوازن الثيول/...

تم تعريف الإجهاد التأكسي في عام 1985 من قبل هيلموت سيز بأنه "اضطراب في التوازن prooxidant-antioxidant لصالح السابق"1، وقد تم إجراء عدد كبير من الأبحاث للحصول على المرض ، والتغذية ، والشيخوخة محددة حالة الأكسدة للكائنات الحية1،2،3. ومنذ ذلك الحين، أصبح فهم الإجهاد التأ المؤسدي أوسع نطاقاً. وقد أظهرت اختبار فرضيات استخدام المواد المضادة للاكسدة ضد الأمراض و / أو الشيخوخة أن الإجهاد التأسدي لا يسبب الضرر فحسب ولكن أيضا أدوار أخرى في الخلايا. وعلاوة على ذلك، فقد أظهر العلماء أن الجذور الحرة تلعب دورا هاما في نقل إشارة2. كل هذه الدراسات تعزيز أهمية تحديد التغيرات في خفض الأكسدة (الأكسدة الحمراء) نسبة الجزيئات الكبيرة. يمكن تقييم نشاط الانزيم ومضادات الأكسدة و / أو المواد المؤكدة ومنتجات الأكسدة بطرق مختلفة. من بين هذه الطرق التي تحدد أكسدة الثيول يمكن القول إن الأكثر استخداما لأنها تقرير عن التوازن بين المواد المضادة للاكسدة وprooxidants في الخلايا، وكذلك الكائنات الحية4. على وجه التحديد، وتستخدم النسب بين الجلوتاثيون (GSH)/الجلوتاثيون ثاني كبريتيد (GSSG) و / أو السيستين (CyS)/السيستين (CySS) كما المؤشرات الحيوية لرصد حالة الأكسدة الكائنات الحية2.
تعتمد الطرق المستخدمة في تحليل التوازن بين البروتوكسيدات ومضادات الأكسدة بشكل رئيسي على مستويات البروتينات المخفضة /المؤكدة أو الجزيئات الصغيرة داخل الخلايا. وتستخدم بقع الغربية وقياس الطيف الشامل لتقييم واسع النطاق نسب الجزيئات الجزئية المتقلصة/المؤكسدة (البروتين، الدهون الخ)، ويمكن تقييم نسب GSH/GSSG مع قياسالطيفي 5. ومن السمات المشتركة لهذه الطرق الانزعاج المادي للنظام عن طريق تجانس الخلايا و/أو الأنسجة. هذه التحليلات أيضاً تصبح صعبة عندما يكون من الضروري قياس حالة الأكسدة من مقصورات الخلوية المختلفة. كل هذه الانزعاجات تسبب التحف في بيئة الفحص.
فتحت البروتينات الفلورية الحساسة للريدox حقبة مفيدة لتقييم توازن الأكسدة الحمراء دون التسبب في اضطراب في الخلايا6. ويمكن أن تستهدف مقصورات مختلفة داخل الخلايا، مما يسمح بالتدبير الكمي للأنشطة الخاصة بالحجرة (على سبيل المثال، فحص حالة الأكسدة الحمراء للميتوكوندريا والسيتوزول) للتحقيق في المحادثات المتبادلة بين العضيات الخلوية. بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) ، البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، والبروتينات HyPeR يتم استعراضها من قبل ماير وزملاؤه6. ومن بين هذه البروتينات، فإن GFP الحساسة للox (roGFP) فريدة من نوعها بسبب قراءات الفلورسنت المختلفة لCyS (488 نانومتر/م 525 نانومتر) وCySS (ex. 405 nm/525 nm) المخلفات، والتي تسمح التحليل النسب، على عكس البروتينات الأخرى الحساسة الأكسدة مثل YFP7،8. نسبة الناتج قيمة لأنه يوازن الفروق بين مستويات التعبير، وحساسيات الكشف، وphotobleaching8. يمكن استهداف مقصورات الخلايا الفرعية (السيتول ، الميتوكوندريا ، النواة) أو الكائنات الحية المختلفة (البكتيريا وكذلك خلايا الثدييات) عن طريق تعديل roGFP7،9،10.
وتجري مقايسات roGFP باستخدام تقنيات التصوير الفلورسنت، وخاصة بالنسبة لتجارب التصور في الوقت الحقيقي. إن التحليلات السيتوميترية لتدفق roGFPs ممكنة أيضًا للتجارب التي لها نقاط زمنية محددة مسبقًا. توضح المقالة الحالية استخدام المجهر الفلورسنت والتدفق للخلايا لإجراء تقييم نسبة لحالة الأكسدة الحمراء في الخلايا الثديية التعبير الزائد عن صوت roGFP (المستهدفة بالcytosol) عبر تحويل أدينوفيرال.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

قياس التوازن بين الخلايا الأكسدة / تخفيض يوفر لمحة عامة عن الحالة الأكسدة الفسيولوجية و / أو المرضية فيزيولوجيا للكائن الحي. ثيولس مهمة بشكل خاص لإلقاء الضوء على حالة الأكسدة من الخلايا عن طريق انخفاض ديثيول ونسبة كبريتيد المؤكد. البروتينات الفلورية المحتوية على السيستين المهندسة تفتح حقبة جديدة لمواسات الاستشعار الحيوي الحساسة للأحمر. واحد منهم، أحمر الأكسدة الخضراء البروتين الفلورسنت (roGFP)، يمكن بسهولة أن تدخل في الخلايا مع تحويل adenoviral، مما يسمح لحالة الأكسدة الحمراء من المقصورات دون الخلوية ليتم تقييمها دون تعطيل العمليات الخلوية. وقد cysteines انخفاض والسيستين المؤكد من roGFP استثارة ماكسيما في 488 نانومتر و 405 نانومتر، على التوالي، مع انبعاث في 525 نانومتر. تقييم نسب هذه الأشكال المخفضة والأكسدة يسمح حساب مريح لتوازن الأكسدة داخل الخلية. في هذه المقالة الطريقة، تم استخدام خلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية البشرية (MDA-MB-231) لتقييم حالة الأكسدة داخل الخلية الحية. وتشمل خطوات البروتوكول MDA-MB-231 خلية خط نقل مع الفيروس الغدي للتعبير عن cytosolic roGFP, العلاج مع H2O2,وتقييم نسبة السيستين والسيستين مع كل من تدفق الخلايا والمجهر الفلورسي.

يتم فحص حالة الأكسدة الحمراء لـ CyS/CySS بسهولة مع roGFPs المستحثة. ويُحدد المسبار الفلوري مقدار النسبة بين الشكلين المخفضين والأكسدة (الطول الموجي للإثارة 488 نانومتر و405 نانومتر على التوالي). يمكن الحصول على بيانات الفلوريسين عن طريق كل من عملية استئصال التدفق والمجهر.
يمكن الحصو...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

يصف هذا البروتوكول تقييم حالة الأكسدة الخاصة بالحجرة الفرعية داخل الخلية. يسمح مسبار الفلورسنت الحساس لل الأكسدة بالتحليل التناسبي المريح في الخلايا السليمة.

تقييم الأكسدة الخلوية باستخدام مقصورة فرعية خاصة ببروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للأكسدة الحمراء

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

المقيّمون البروتوكول الحاليون في النسيج، تتغير حالة الأكسدة الحمراء بطريقة خاصة بالحجرة داخل الخلايا. بروتوكول لدينا تمكن من فهم أفضل ورصد جميع الآليات الفسيولوجية أو الفيزيولوجية من الإجهاد التأ المؤسد. تسمح هذه التقنية بالتدميم الكمي غير التخريبي لنسبة كبريتيد العين المبلط في الخلايا السليمة باستخدام مخرج قياسي نسبة لموازنة الاختلافات بين مستويات التعبير إشارة، تبييض الصور، والكشف عن الحساسيات.يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الكائنات الحية المختلفة، بما في ذلك البكتيريا في النباتات. في اليوم الأول من التجربة علاج الخلايا من خط خلية سرطان الثدي التقاء لمدة دقيقتين، مع ملليلتر من 0.2، 5٪ رحلات في EDTA. عندما تبدأ الخلايا لفصل القبض على رد الفعل مع ستة ملليلتر من كامل المتوسطة والرواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من الطازجة, متوسطة كاملة, عد الخلايا وتمييع لهم إلى 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم البذور 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من الخلايا في بئر في لوحة 6 جيدا، واحتضان الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. أو لا تضيف أي الصف الفيروسية GFP نقل.في صباح اليوم التالي، إضافة 12.5، 25، و 50 ميكرولتر من واحد إلى 100 المخفف ست مرات 10 إلى تشكيل وحدات البلاك 10 لكل ملليلتر من إضافة أي فيروس تآكل حل GFP، في المتوسطة كاملة. إضافة إلى أن الآبار المناسبة أو 6 آبار لوحة لtransduce الخلايا مع 50 و 100 و 200 تعدد العدوى، على التوالي. عندما تم نقل كل من الآبار عينة مع الفيروس، والعودة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 16 إلى 24 ساعة.في اليوم التالي، تصور الخلايا عن طريق المجهر الفلوريستين واستبدال نابيرنت مع المتوسطة، دون فيروس للسماح للخلايا لاسترداد لمدة 24 ساعة إضافية. لتحديد الكفاءة المثلى في عملية النقل، قم بتقييم كثافة الفلورس ومورفولوجيا الخلايا بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. تأكد من إجراء جميع الإجراءات التي يمكن أن تسبب العدوى من الهباء الجوي أو البقع داخل مستوى السلامة البيولوجية اثنين من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المعتمدة.لتقييم حالة الأكسدة الحمراء للخلايا ، في صباح اليوم التالي ، احتضان الخلايا والآبار المناسبة من لوحة 6 بئر مع 10 بيروكسيد الهيدروجين ميكرومولار لمدة ساعة واحدة ، قبل فصل الخلايا مع 750 ميكرولترات من 0.2 ٪ التنقيط في EDTA في البئر ، كما ثبت. وقف التفاعل مع مليلترين من المتوسط الكامل في البئر وسحب supernatants لكل حالة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الكريات في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر عن طريق الطرد المركزي مرتين.بعد الغسيل الثاني، قم بتصفية تعليق الخلايا من خلال 40 مترًا صغيرًا في أنابيب متوافقة مع قياس الخلايا على الجليد، محمية من الضوء. في برنامج مقياس التدفق، قم بتشغيل التعدد الصفري لعينة التحكم في العدوى. ثم تحليل بيروكسيد الهيدروجين والخلايا غير المعالجة.وسيتيح حساب متوسط نسبة كثافة الفلورسنت بين الأشكال المؤكدة مقابل الأشكال المخفضة للصف من أجل الانبعاثات الإجمالية، باستخدام الصيغة كما هو مبين. وهنا تظهر استراتيجية الغات لاختيار عدد كبير من الخلايا عن طريق تدفق cytometry. ويمكن أيضا أن تستخدم تدفق cytometry لتحديد منحنى استجابة الجرعة لتحليل GFP الصف والتعدد الأكثر كفاءة من مدخلات العدوى.وفقا لتعدد العدوى، منحنى استجابة الجرعة في هذا التحليل التمثيلي، و 200 تعدد العدوى أعطى أعلى تعبير GFP الطريق، ولكن تم تنفيذ مورفولوجيا الخلية مما يوحي السمية الخلوية. ولذلك، تم تحديد كفاءة النقل الأمثل لتكون تعدد العدوى من 100. في هذا التحليل حالة الأكسدة، وأكسدة وانخفاض الصف GFP يعني تم الحصول على كثافة الفلوريسنس من تحليل تدفق قياس خلايا للمركبة وأربعة 10 ميكرومولار إيجابية التحكم في علاجات بيروكسيد الهيدروجين.تمثل الرسوم البيانية المتراكبة التحولات في رقم الخلية في 10 ميكرومولار بيروكسيد الهيدروجين والمجموعات المعالجة مركبة أو انخفاض وأكسدة تآكل GFP. وحساب النسبة بين الصف المؤسد والمخفض GFP لهذا التحليل كشف أن 10 ميكرومولار بيروكسيد الهيدروجين تسبب في زيادة ثلاثة أضعاف في أكسدة الصف GFP مقارنة مع معالجة السيارة. وجود أرقام الخلايا دقيقة مهم لحسابات التصوير بالرنين المغناطيسي وإعادة إنتاج.من أجل الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ ، يجب على الباحثين خلط الحلول المضادة للفيروسات بشكل شامل للحصول على تعليق متجانس. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بدراسة التغيرات السريعة في الأكسدة الحمراء كجزء لا يتجزأ من النطاق الواسع للعمليات الخلوية العادية وتطور المرض في الوقت الحقيقي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

استخراج وتحليل للتايوانيين دنج الأخضر

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...