Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

De construct en recombinant adenovirus voor het uitdrukken van cytosol-specifieke roGFP in cellen werden gegenereerd in het laboratorium van Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, en ViraQuest Inc, respectievelijk. Deze studie werd ondersteund door het Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 via het NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. De flow cytometry core faciliteit werd gedeeltelijk ondersteund door het Center for Microbial Pathogenese en Host Inflammatory Responses grant P20GM103625 via de COBRE NIGMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het NIH. ATA werd ondersteund door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TUBITAK) 2214-A beurs.

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 70%-80% confluent MDA-MB-231 cellen. Voor andere cellijnen moet het aantal cellen en de veelheid van infectie (MOI) opnieuw worden geoptimaliseerd.
1. Bereiding van cellen (dag 1)
<ol><li>Houd de MDA-MB-231 cellijn in 75 cm2 kolven met 10 mL gemodificeerd Eagle medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. OPMERKING: DMEM aangevuld met 10% FBS,...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

De thiol/disulfide balans in een organisme weerspiegelt de redoxstatus van cellen. Levende organismen hebben glutathion, cysteïne, eiwittholen en thiolen met een laag moleculair gewicht, die allemaal worden beïnvloed door het oxidatieniveau en echo van de redoxstatus van cellen4. Engineered roGFP's maken de niet-verstorende kwantificering van het thiol/disulfide-saldo mogelijk via hun CyS-residuen7. De ratiometrische eigenschap van roGFP biedt betrouwbare redoxmetingen vo...

Oxidatieve stress werd gedefinieerd in 1985 door Helmut Sies als "een verstoring in prooxidant-antioxidant evenwicht ten gunste van de eerste"1, en een overvloed aan onderzoek is uitgevoerd om ziekte-, voeding-, en veroudering-specifieke redox status van organismen1,2,3te verkrijgen . Sindsdien is het begrip van oxidatieve stress breder geworden. Het testen van de hypothesen van het gebruik van antioxidanten tegen ziekten en/of veroudering heeft aangetoond dat oxidatieve stress niet alleen schade veroorzaakt, maar ook andere rollen in cellen heeft. Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat vrije radicalen een belangrijke rol spelen bij signaaltransductie2. Al deze studies versterken het belang van het bepalen van de veranderingen in de reductie-oxidatie (redox) verhouding van macromoleculen. Enzymactiviteit, antioxidanten en/of oxidanten en oxidatieproducten kunnen met verschillende methoden worden beoordeeld. Onder deze, methoden die thiol oxidatie te bepalen zijn misschien wel de meest gebruikte omdat ze rapporteren over de balans tussen antioxidanten en prooxidanten in cellen, evenals organismen4. Specifiek worden verhoudingen tussen glutathion (GSH)/glutathione disulfide (GSSG) en/of cysteïne (CyS)/cystine (CySS) gebruikt als biomarkers voor het monitoren van de redoxstatus van organismen2.
Methoden die worden gebruikt voor het testen van de balans tussen prooxidanten en antioxidanten zijn voornamelijk afhankelijk van de niveaus van verminderde / geoxideerde eiwitten of kleine moleculen in cellen. Westerse vlekken en massaspectrometrie worden gebruikt om de verhoudingen van verminderde/geoxideerde macromoleculen (eiwit, lipiden enz.) breed te beoordelen, en GSH/GSSG-verhoudingen kunnen worden beoordeeld met spectrofotometrie5. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze methoden is de fysieke verstoring van het systeem door cellyse en/of weefselhomogenisatie. Deze analyses worden ook uitdagend wanneer het nodig is om de oxidatiestatus van verschillende cellulaire compartimenten te meten. Al deze verstoringen veroorzaken artefacten in de testomgeving.
Redox-gevoelige fluorescerende eiwitten openden een gunstig tijdperk voor het evalueren van de redoxbalans zonder een verstoring in de cellen6te veroorzaken. Ze kunnen zich richten op verschillende intracellulaire compartimenten, waardoor de kwantificering van compartimentspecifieke activiteiten (bijvoorbeeld de redoxtoestand van mitochondriën en de cytosol) kan worden geflankeerd om kruisspraak tussen cellulaire organellen te onderzoeken. Geel fluorescerend eiwit (YFP), groen fluorescerend eiwit (GFP) en HyPeR-eiwitten worden beoordeeld door Meyer en collega's6. Onder deze eiwitten is redox-gevoelige GFP (roGFP) uniek vanwege verschillende fluorescerende uitlezingen van zijn CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) en CySS (ex. 405 nm/525 nm) residuen, waardoor ratiometrische analyse mogelijk is, in tegenstelling tot andere redoxgevoelige eiwitten zoals YFP7,8. Ratiometrische output is waardevol omdat het een tegenwicht biedt aan de verschillen tussen expressieniveaus, detectiegevoeligheden en photobleaching8. Subcellulaire compartimenten van cellen (cytosol, mitochondriën, kern) of verschillende organismen (bacteriën en zoogdiercellen) kunnen worden gericht door roGFP7,9,10te wijzigen .
roGFP-testen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende beeldvormingstechnieken, vooral voor real-time visualisatie-experimenten. Flow cytometrische analyses van roGFP's zijn ook mogelijk voor experimenten met vooraf bepaalde tijdstippen. Het huidige artikel beschrijft zowel het gebruik van fluorescerende microscopie als stroomcytometrie om een ratiometrische beoordeling van de redox-toestand in zoogdiercellen uit te voeren die roGFP (gericht op cytosol) via adenovirale transductie overpreiden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

Het meten van de intracellulaire oxidatie/reductiebalans geeft een overzicht van de fysiologische en/of pathofysiologische redox-status van een organisme. Thiolen zijn vooral belangrijk voor het verlichten van de redox-status van cellen via hun verminderde dithiol en geoxideerde disulfide ratio's. Engineered cysteïne-bevattende fluorescerende eiwitten openen een nieuw tijdperk voor redox-gevoelige biosensoren. Een van hen, redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (roGFP), kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met adenovirale transductie, waardoor de redox-status van subcellulaire compartimenten kunnen worden geëvalueerd zonder cellulaire processen te verstoren. Verminderde cysteines en geoxideerde cystines van roGFP hebben excitatie maxima op respectievelijk 488 nm en 405 nm, met emissie op 525 nm. Door de verhoudingen van deze verlaagde en geoxideerde vormen te beoordelen, kan de balans van redox in de cel gemakkelijk worden berekend. In deze methode artikel, vereeuwigd menselijke drievoudige negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231) werden gebruikt om redox status te beoordelen binnen de levende cel. De protocolstappen omvatten MDA-MB-231 cellijntransductie met adenovirus om cytosolische roGFP uit te drukken, behandeling met H2O2, en beoordeling van cysteïne en cystineverhouding met zowel stroomcytometrie als fluorescentiemicroscopie.

De redoxtoestand van CyS/CySS is gemakkelijk te testen met getransduceerde roGFP's. De fluorescerende sonde kwantificeert de verhouding tussen de verlaagde en geoxideerde vormen (excitatiegolflengten respectievelijk 488 nm en 405 nm). Fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen door zowel flow cytometrie en microscopie.
Een groot aantal cellen kan consequent en gemakkelijk worden verkregen met behulp van stroom cytometrie. De analyse bestaat uit 3 hoofdstappen: 1) selecteer de celpopulatie ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Huidige protocolbeoordelaars in textiel, redox toestand veranderingen in een intracellulaire compartiment-specifieke manier. Ons protocol maakt een beter begrip en monitoring van alle fysiologische of pathofysiologische mechanismen van oxidatieve stress mogelijk. Deze techniek maakt het mogelijk om de betegelde verhouding van het oogsulfide in intacte cellen niet-verstorend te kwantificeren met behulp van een ratiometrische output om de verschillen tussen signaalexpressieniveaus, fotobleektechnologie en detectiegevoeligheden te compenseren.Dit protocol kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën in planten. Op dag één van het experiment behandelen de cellen van een confluent borstkankercellijn gedurende twee minuten, met twee milliliter van 0,2, 5%-trips in EDTA. Wanneer de cellen beginnen te los arrestatie de reactie met zes milliliter van volledig medium en sediment de cellen door centrifugatie.Stel de pellet opnieuw op in vijf milliliter vers, compleet medium, tel de cellen en verdun ze tot 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per één milliliter compleet medium. Dan zaad 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter cellen per put in een 6 put plaat, en incubeer de cellen in de celcultuur incubator 's nachts. Of voeg geen virale rij GFP transductie.De volgende ochtend, voeg 12,5, 25, en 50 microliter van een een tot 100 verdund zes keer 10 aan de 10e plaque vormen eenheden per milliliter van voeg geen virale gfp-oplossing, in compleet medium. Voeg dat toe aan de juiste putten of de 6 putplaat om de cellen met respectievelijk 50, 100 en 200 multiplicities van infectie om te leiden. Wanneer alle van het monster Putten zijn getransduceerd met virus, de cellen terug te keren naar de cel cultuur incubator voor 16 tot 24 uur.De volgende dag visualiseren de cellen door fluorescentie microscopie en verving de supernatant met medium, zonder virus om de cellen te herstellen voor een extra 24 uur. Om de optimale transductie-efficiëntie te bepalen, beoordeelt u de fluorescentieintensiteit en morfologie van de cellen door stromingscytometrie. Zorg ervoor dat u alle procedures die infectie kunnen veroorzaken door aerosolen of spatten binnen een bioveiligheid niveau twee gecertificeerde biologische veiligheid kabinet uit te voeren.Om de redoxstatus van de cellen te beoordelen, broeden de cellen en de juiste putten van de 6 putplaat gedurende een uur met 10 micromolar waterstofperoxide uit, voordat de cellen worden losgemaakt met 750 microliter van 0,2 5%druppels in EDTA per put, zoals aangetoond. Stop de reactie met twee milliliter van volledig medium per put en trek de supernatants voor elke aandoening in individuele 15 milliliter conische buizen. Sediment de cellen door centrifugatie en was de pellets in 500 microliters van PBS per put door centrifugaties twee keer.Na de tweede wasbeurt, filter de cel schorsingen door 40 micro meter mazen in flow cytometrie compatibele buizen op ijs, beschermd tegen licht. In de Flow cytometer software, voer de nul multipliciteit van infectie controle monster. Analyseer vervolgens de waterstofperoxide en onbehandelde cellen.Hiermee kan de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen de geoxideerde versus gereduceerde vormen van rijGFP worden berekend, met behulp van de formule zoals aangegeven. Hier zijn de gating strategie voor het selecteren van een groot aantal cellen door flow cytometrie wordt getoond. Flow cytometrie kan ook worden gebruikt om de dosis respons curve voor rij GFP-analyse en de meest efficiënte veelheid van infectie input te bepalen.Volgens de veelheid van infectie, dosis respons curve in deze representatieve analyse, een 200 veelheid van infectie gaf de hoogste weg GFP expressie, maar de cel morfologie werd uitgevoerd suggereert cytotoxiciteit. Daarom werd de optimale transductie-efficiëntie vastgesteld op een veelheid van infectie van 100. In deze redox status analyse, geoxideerd en verminderde rij GFP gemiddelde fluorescentie intensiteiten werden verkregen uit flow cytometrie analyse voor voertuig en vier 10 micromolar positieve controle waterstofperoxide behandelingen.De bedekte histogrammen vertegenwoordigen de verschuivingen in het celnummer in de 10 micromolar waterstofperoxide en voertuig behandelde groepen of verminderd en geoxideerd eroderen GFP. Berekening van de verhouding tussen de geoxideerde en verminderde rij GFP voor deze analyse bleek dat 10 micromolar waterstofperoxide veroorzaakt een drievoudige toename van oxidatie van rij GFP in vergelijking met de behandeling van het voertuig. Het hebben van nauwkeurige celnummers is belangrijk voor MRI-berekeningen en reproduceerbaarheid.Om reproduceerbare resultaten te hebben, moeten onderzoekers de antivirale oplossingen grondig mengen om homogene suspensies te verkrijgen. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om snelle redoxveranderingen te bestuderen als een integraal onderdeel van het brede scala van normale cellulaire processen en van ziekteprogressie in real time.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extractie en analyse van Taiwanese groene Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek