Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Das Konstrukt und rekombinante Adenovirus zur Exdinierung von Cytosol-spezifischem RoGFP in Zellen wurden im Labor von Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University und ViraQuest Inc. erzeugt. Diese Studie wurde vom Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy Grant P20GM109005 durch das NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program Grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor es Awards AWD00053484. Die Durchflusszytometrie-Kernanlage wurde teilweise vom Center for Microbial Pathogenesis und Host Inflammatory Responses Grant P20GM103625 über das COBRE NIGMS unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. ATA wurde vom Wissenschafts- und Technologieforschungsrat der Türkei (TUBITAK) 2214-A Stipendium unterstützt.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für 70 % –80 % konfluente MDA-MB-231-Zellen optimiert. Bei anderen Zelllinien sollten die Anzahl der Zellen und die Vielzahl der Infektionen (MOI) neu optimiert werden.
1. Vorbereitung der Zellen (Tag 1)
<ol><li>MDA-MB-231 Zelllinie in 75 cm2 Kolben mit 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) zu halten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einer 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre. HINWEIS: DMEM, ergänzt du...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

Das Thiol/Disulfid-Gleichgewicht in einem Organismus spiegelt den Redoxstatus von Zellen wider. Lebende Organismen haben Glutathion, Cystein, Proteinthiole und niedermolekulare Thiole, die alle von der Oxidation betroffen sind und den Redoxstatus der Zellen4wiedergeben. Technische ROGFPs ermöglichen die unterbrechungsfreie Quantifizierung des Thiol/Disulfid-Gleichgewichts über ihre CyS-Rückstände7. Die ratiometrische Eigenschaft von roGFP liefert zuverlässige Redoxmess...

Oxidativer Stress wurde 1985 von Helmut Sies als "Störung des prooxidant-antioxidativen Gleichgewichts zu Gunsten des ersten"definiert,und es wurde eine Fülle von Forschungsarbeiten durchgeführt, um einen krankheits-, ernährungs- und alterungsspezifischen Redoxstatus von Organismen1,2,3zu erhalten. Seitdem ist das Verständnis von oxidativem Stress breiter geworden. Das Testen der Hypothesen der Verwendung von Antioxidantien gegen Krankheiten und/oder Alterung hat gezeigt, dass oxidativer Stress nicht nur Schaden verursacht, sondern auch andere Rollen in Zellen spielt. Darüber hinaus haben Wissenschaftler gezeigt, dass freie Radikale eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion2spielen. Alle diese Studien stärken die Bedeutung der Bestimmung der Veränderungen des Reduktions-Oxidations-Verhältnisses (Redox) von Makromolekülen. Enzymaktivität, Antioxidantien und/oder Oxidationsmittel sowie Oxidationsprodukte können mit verschiedenen Methoden bewertet werden. Unter diesen, Methoden, die Thiol-Oxidation bestimmen sind wohl die am häufigsten verwendeten, weil sie über das Gleichgewicht zwischen Antioxidantien und Prooxidantien in Zellen berichten, sowie Organismen4. Insbesondere werden die Verhältnisse zwischen Glutathion (GSH)/Glutathiondisulfid (GSSG) und/oder Cystein (CyS)/Cystin (CySS) als Biomarker zur Überwachung des Redoxstatus von Organismen2verwendet.
Methoden, die zur Aschägung des Gleichgewichts zwischen Prooxidanzien und Antioxidantien verwendet werden, basieren hauptsächlich auf dem Niveau reduzierter/oxidierter Proteine oder kleiner Moleküle in Zellen. Westliche Flecken und Massenspektrometrie werden verwendet, um die Verhältnisse von reduzierten/oxidierten Makromolekülen (Protein, Lipide usw.) umfassend zu bewerten, und GSH/GSSG-Verhältnisse können mit Spektrophotometrie5bewertet werden. Ein gemeinsames Merkmal dieser Methoden ist die physikalische Störung des Systems durch Zelllyse und/oder Gewebehomogenisierung. Diese Analysen werden auch dann schwierig, wenn es notwendig ist, den Oxidationsstatus verschiedener Zellkompartimente zu messen. Alle diese Störungen verursachen Artefakte in der Assay-Umgebung.
Redoxempfindliche fluoreszierende Proteine eröffneten eine vorteilhafte Ära zur Bewertung des Redoxgleichgewichts, ohne eine Störung in den Zellen zu verursachen6. Sie können verschiedene intrazelluläre Kompartimente ins Visier nehmen, um die Quantifizierung von kompartifenspezifischen Aktivitäten (z. B. Die Untersuchung des Redoxzustands von Mitochondrien und des Zytosols) zu ermöglichen, um das Übersprechen zwischen zellulären Organellen zu untersuchen. Gelbefluoreszenzproteine (YFP), grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und HyPeR-Proteine werden von Meyer undKollegen6 überprüft. Unter diesen Proteinen ist Redox-sensitive sywertGFP (roGFP) aufgrund unterschiedlicher fluoreszierender Auslesungen seiner CyS (z.B. 488 nm/em. 525 nm) und CySS (z.B. 405 nm/525 nm) Rückstände einzigartig, was im Gegensatz zu anderen Redox-empfindlichen Proteinen wie YFP7,8eine ratiometrische Analyse ermöglicht, was eine ratiometrische Analyse ermöglicht. Die ratiometrische Ausgabe ist wertvoll, da sie die Unterschiede zwischen Expressionsstufen, Erkennungsempfindlichkeiten und Photobleaching8ausbalanciert. Subzelluläre Kompartimente von Zellen (Zytosol, Mitochondrien, Kern) oder verschiedenen Organismen (Bakterien sowie Säugetierzellen) können durch Modifizieren von roGFP7,9,10gezielt werden.
roGFP-Assays werden mit fluoreszierenden Bildgebungstechniken durchgeführt, insbesondere für Echtzeit-Visualisierungsexperimente. Flow-zytometrische Analysen von roGFPs sind auch für Experimente mit vorgegebenen Zeitpunkten möglich. Der aktuelle Artikel beschreibt sowohl die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie als auch die Durchflusszytometrie, um eine ratiometrische Bewertung des Redoxstatus in Säugetierzellen durchzuführen, die roGFP (gezielt auf Zytosol) über adenovirale Transduktion überexzieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

Die Messung des intrazellulären Oxidations-/Reduktionsgleichgewichts bietet einen Überblick über den physiologischen und/oder pathophysiologischen Redoxstatus eines Organismus. Thiole sind besonders wichtig für die Beleuchtung des Redoxstatus von Zellen über ihre reduzierten Dithiol- und oxidierten Disulfidverhältnisse. Entwickelte cysteinhaltige fluoreszierende Proteine eröffnen eine neue Ära für Redox-empfindliche Biosensoren. Eines davon, redoxsensitives grünes fluoreszierendes Protein (roGFP), kann leicht in Zellen mit adenoviraler Transduktion eingeführt werden, so dass der Redoxstatus subzellulärer Kompartimente ausgewertet werden kann, ohne zelluläre Prozesse zu stören. Reduzierte Cysteins und oxidierte Zystiker von roGFP haben Anregungsmaxima bei 488 nm bzw. 405 nm, mit Emission bei 525 nm. Die Beurteilung der Verhältnisse dieser reduzierten und oxidierten Formen ermöglicht die bequeme Berechnung des Redox-Gleichgewichts innerhalb der Zelle. In diesem Methodenartikel wurden verewigte menschliche dreifach-negative Brustkrebszellen (MDA-MB-231) verwendet, um den Redoxstatus innerhalb der lebenden Zelle zu bewerten. Die Protokollschritte umfassen MDA-MB-231 Zelllinientransduktion mit Adenovirus zur Exprimierbarkeit von Zytosol-RoGFP, Behandlung mit H2O2und Bewertung des Cystein- und Cystin-Verhältnisses mit Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.

Der Redoxzustand von CyS/CySS lässt sich leicht mit transduzierten RoGFPs überprüfen. Die fluoreszierende Sonde quantifiziert das Verhältnis zwischen den reduzierten und oxidierten Formen (Erregungswellenlängen 488 nm bzw. 405 nm). Fluoreszenzdaten können sowohl durch Durchflusszytometrie als auch durch Mikroskopie ermittelt werden.
Eine große Anzahl von Zellen kann konsistent und bequem mit Durchflusszytometrie erfasst werden. Die Analyse besteht aus 3 Hauptschritten: 1) Wählen Sie di...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Aktuelle Protokollbewerter in Textil- und Redoxzustandsänderungen in intrazellulärer Kompartiment-spezifisch. Unser Protokoll ermöglicht ein besseres Verständnis und überwachung aller physiologischen oder pathophysiologischen Mechanismen von oxidativem Stress. Diese Technik ermöglicht eine unterbrechungsfreie Quantifizierung des gefliesten Augensulfid-Verhältnisses in intakten Zellen unter Verwendung einer ratiometrischen Ausgabe, um die Unterschiede zwischen Signalexpressionsniveaus, Fotobleichungen und Erkennungsempfindlichkeiten auszugleichen.Dieses Protokoll kann auf verschiedene Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien in Pflanzen. Am ersten Tag des Experiments behandeln die Zellen aus einer konfluenten Brustkrebs-Zelllinie für zwei Minuten, mit zwei Millilitern von 0,2, 5%Trips in EDTA. Wenn die Zellen beginnen, die Reaktion mit sechs Millilitern des vollständigen Mediums zu lösen und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.Das Pellet in fünf Milliliter frisches, vollständiges Medium aussetzen, die Zellen zählen und auf 1,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro einem Milliliter kompletten Medium verdünnen. Dann säen Sie 1,5 mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte, und inkubieren sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator über Nacht. Oder fügen Sie keine virale Zeile GFP-Transduktion hinzu.Am nächsten Morgen, fügen Sie 12,5, 25 und 50 Mikroliter eines ein bis 100 verdünnt sechs mal 10 der 10. Plaque bildende Einheiten pro Milliliter hinzufügen keine virale erodierte GFP-Lösung, in vollständigem Medium. Fügen Sie dies zu den entsprechenden Brunnen oder die 6 Brunnenplatte hinzu, um die Zellen mit 50, 100 bzw. 200 Infektionsmultiplizitäten zu transducieren. Wenn alle Proben Wells mit Virus transduziert wurden, kehren Sie die Zellen für 16 bis 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.Am nächsten Tag visualisieren Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie und ersetzen Sie den Überstand durch Medium, ohne Virus, damit sich die Zellen für weitere 24 Stunden erholen können. Um die optimale Transduktionseffizienz zu bestimmen, bewerten Sie die Fluoreszenzintensität und Morphologie der Zellen durch Durchflusszytometrie. Achten Sie darauf, alle Verfahren durchzuführen, die Infektionen durch Aerosole oder Spritzer innerhalb eines Biosicherheitsniveaus zwei zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank verursachen können.Um den Redoxstatus der Zellen zu bewerten, bebrüten Sie am nächsten Morgen die Zellen und die entsprechenden Wells der 6 Well-Platte mit 10 mikromolarem Wasserstoffperoxid für eine Stunde, bevor Sie die Zellen mit 750 Mikrolitern 0,2 5%Tropfen in EDTA pro Brunnen ablösen, wie gezeigt. Stoppen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern komplettem Medium pro Brunnen und ziehen Sie die Überstände für jeden Zustand in einzelnen 15 Milliliter konischen Rohren. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Pellets in 500 Mikroliter PBS pro Brunnen durch Zentrifugationen zweimal.Filtern Sie die Zellsuspensionen nach der zweiten Wäsche durch 40 Mikrometer-Netze in strömungszytometriekompatible Rohre auf Eis, die vor Licht geschützt sind. Führen Sie in der Flow-Zytometer-Software die Null-Multiplizität der Infektionskontrollprobe aus. Analysieren Sie dann das Wasserstoffperoxid und unbehandelte Zellen.Es wird die Berechnung des mittleren fluoreszierenden Intensitätsverhältnisses zwischen den oxidierten und reduzierten Formen des ReihenGFP ermöglichen, unter Verwendung der angegebenen Formel. Hier ist die Gating-Strategie für die Auswahl einer großen Anzahl von Zellen durch Durchflusszytometrie wird gezeigt. Die Durchflusszytometrie kann auch verwendet werden, um die Dosis-Antwort-Kurve für die Rand-GFP-Analyse und die effizienteste Multiplizität der Infektionseingaben zu bestimmen.Nach der Vielzahl der Infektion, Dosis-Reaktions-Kurve in dieser repräsentativen Analyse, eine 200 Vielzahl von Infektionen gab die höchste Straße GFP-Expression, aber die Zellmorphologie wurde durchgeführt, die Zytotoxizität suggeriert. Daher wurde die optimale Transduktionseffizienz als eine Vielzahl von Infektionen von 100 bestimmt. In dieser Redoxstatusanalyse wurden oxidierte und reduzierte Reihen-GFP-Mittelfluoreszenzintensitäten aus der Durchflusszytometrie-Analyse für Fahrzeuge und vier 10 mikromolaren Positivkontroll-Wasserstoffperoxid-Behandlungen erhalten.Die überlagerten Histogramme stellen die Verschiebungen der Zellzahl in den 10 mikromollaren Wasserstoffperoxid- und fahrzeugbehandelten Gruppen oder reduzierten und oxidierten Erodieren GFP dar. Die Berechnung des Verhältnisses zwischen dem oxidierten und reduzierten Reihen-GFP für diese Analyse ergab, dass 10 mikromolares Wasserstoffperoxid eine Verdreifachung der Oxidation des ReihenGFP im Vergleich zur Fahrzeugbehandlung verursachte. Genaue Zellzahlen sind wichtig für MRT-Berechnungen und Reproduzierbarkeit.Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, sollten die Forscher die antiviralen Lösungen gründlich mischen, um homogene Suspensionen zu erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, schnelle Redox-Änderungen als integralen Bestandteil des breiten Spektrums normaler zellulärer Prozesse und des Krankheitsverlaufs in Echtzeit zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur-Lösung von den fluoreszierenden Proteins Himmelblau mit MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extraktion und Analyse der taiwanesischen grünen Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek