Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
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細胞内の細胞ゾル特異的roGFPを発現するための構築および組換えアデノウイルスは、それぞれポール・T・シューマッカー博士、フライベルク医学部、ノースウェスタン大学、ViraQuest Inc.の研究室で生成された。この研究は、NIH国立一般医学研究所生物医学研究優秀センター(COBRE NIGMS)、国立総合医療科学システム薬理学および毒物学トレーニングプログラム助成金T32 GM106999を通じて、がん治療に対する宿主反応研究センターが支援しました。 UAMS財団/医学研究基金賞AWD00053956、UAMS年末首相賞AWD00053484。フローサイトメトリーコア施設は、微生物病態および宿主炎症反応センターがCOBRE NIGMSを通じてP20GM103625を付与することによって部分的に支えられた。コンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。ATAはトルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)2214-A奨学金によって支援されました。

注: このプロトコルは、70%~80% コンフルエント MDA-MB-231 セルに最適化されました。他の細胞株の場合、細胞数と感染の多重度(MOI)を再最適化する必要があります。
1. 細胞の調製(1日目)
<ol><li>MDA-MB-231細胞株を、5%CO2加湿雰囲気で37°Cで10%の胎児ウシ血清(FBS)を添加したダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)10 mLの75 cm2フラスコで維持します。2 注:DMEMは10%FBS?...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

生物におけるチオール/ジスルフィドバランスは、細胞の酸化還元状態を反映する。生物はグルタチオン、システイン、プロテインチオール、低分子チオールを有し、そのすべてが細胞4の酸化レベルに影響され、酸化状態をエコーする。工学的roGFPはCyS残基7を介してチオール/ジスルフィドバランスの無停止定量化を可能にする。roGFPのレシオメトリック特?...

酸化ストレスは、1985年にヘルムート・シーズによって「前者に有利なプロキシダント抗酸化バランスの乱れ」として定義され、多くの研究が行われ、生物1、2、32,の疾患、栄養、および老化特異的な酸化還元状態を得1るために多くの研究が行われている。3それ以来、酸化ストレスの理解はより広がっています。病気や老化に対して抗酸化物質を使用する仮説をテストすると、酸化ストレスが害を引き起こすだけでなく、細胞内の他の役割も持っていることを示しています。さらに、科学者たちは、フリーラジカルがシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを示している。これらの研究のすべては、高分子の還元酸化(酸化還元)比の変化を決定することの重要性を強化します。酵素活性、酸化防止剤、酸化産物、酸化生成物は、様々な方法で評価することができます。これらの中で、チオール酸化を決定する方法は、細胞内の抗酸化物質とプロオキシド物質のバランス、ならびに生物4とのバランスについて報告するので、間違いなく最も使用されている。具体的には、グルタチオン(GSH)/グルタチオンジスルフィド(GSSG)および/またはシステイン(CyS)/シスチン(CySS)との比率が、生物の酸化還元状態をモニタリングするためのバイオマーカーとして使用される2。
プロオキシド剤と抗酸化物質のバランスをアッセリングするために使用される方法は、主に還元/酸化タンパク質または細胞内の小分子のレベルに依存します。ウェスタンブロットおよび質量分析は、還元/酸化された高分子(タンパク質、脂質など)の比率を広く評価するために使用され、GSH/GSSG比は分光光度測定5で評価することができる。これらの方法の一般的な特徴は、細胞のリシスおよび/または組織均質化によるシステムの物理的摂動である。これらの分析は、異なる細胞コンパートメントの酸化状態を測定する必要がある場合にも困難になります。これらの摂動はすべてアッセイ環境で人工物を引き起こす。
レドックス感受性蛍光タンパク質は、細胞内の妨害を引き起こすことなく酸化還元バランスを評価するための有利な時代を開いた6.それらは異なる細胞内区画を標的とすることができ、細胞小器官間のクロストークを調査するためにコンパートメント特有の活動(例えば、ミトコンドリアとサイトゾルのレドックス状態をアッサイル)の定量化を可能にする。黄色蛍光タンパク質(YFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HyPeRタンパク質が、マイヤーと同グループの研究グループによってレビューされる。これらのタンパク質の中で、酸化還元感受性GFP(roGFP)は、そのCyS(例えば488 nm/em.525 nm)およびCySS(例えば405 nm/525 nm)残基の異なる蛍光読み出しに起因するユニークであり、YFP77、88などの他のレドックス感受性タンパク質とは異なり、比量分析を可能にする。レシオメトリック出力は、式レベル、検出感度、およびフォトブリーチ8の差を相殺するので、価値があります。細胞の細胞内区画(細胞ゾル、ミトコンドリア、核)または異なる生物(細菌ならびに哺乳類細胞)は、roGFP7、9、109,を修飾7することによって標的とすることができる。10
roGFPアッセイは、特にリアルタイム可視化実験のために、蛍光イメージング技術を用いて行われる。また、所定の時間ポイントを用いた実験では、roGPSのフローサイトメトリック解析も可能です。現在の記事では、アデノウイルス伝達を介してroGFP(細胞質を標的とする)を過剰発現する哺乳類細胞におけるレドックス状態の比率評価を行う蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーの両方について説明しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

細胞内酸化/還元バランスを測定すると、生物の生理学的および/または病的な生理学的なレドックスの状態の概要を提供します。チオールは、ジチオールと酸化ジスルフィド比を使用して細胞の酸化還元状態を照らすのに特に重要です。設計されたシステイン含有蛍光タンパク質は、レドックス感受性バイオセンサーの新しい時代を開きます。そのうちの一つは、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質(roGFP)を、アデノウイルス伝達を伴う細胞に容易に導入することができ、細胞内のレドックス状態を細胞内プロセスを中断させることなく評価することができる。roGFPの減少したシステインおよび酸化シスチンは、それぞれ488nmおよび405nmで励起最大量を有し、525nmで発光する。これらの還元および酸化形態の比率を評価することで、細胞内の酸化還元バランスの計算が便利になります。この方法記事では、ヒト三重陰性乳癌細胞(MDA-MB-231)を使用して、生細胞内の酸化還元状態を評価した。プロトコルステップには、細胞細胞群roGFPを発現させるアデノウイルスによるMDA-MB-231細胞株の伝達、H2O2による治療、2およびフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の両方を用いたシステインおよびシスチン比の評価が含まれる。

CyS/CySSのレドックス状態は、トランスデューセロフェスで簡単にアッセイされます。蛍光プローブは、還元型と酸化形態(励起波長488nmおよび405nm)の比率を定量化します。蛍光データは、フローサイトメトリーと顕微鏡の両方で得ることができます。
多数の細胞がフローサイトメトリーを用いて一貫してかつ便利に獲得できる。分析は3つの主要なステップで構成されてい?...

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Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

テキスタイルにおける現在のプロトコル評価者は、細胞内コンパートメント特異的な方法で酸化還元状態が変化する。我々のプロトコルは、より良い理解を可能にし、酸化ストレスのすべての生理学的または病的生理学的メカニズムを監視する。この技術により、シグナル発現レベル、写真漂白、検出感度の差を相殺するために、比率メトリック出力を使用して、無傷細胞のタイル眼硫化物比を無停止で定量できます。このプロトコルは、植物中の細菌を含む様々な生物に適用することができる。実験の1日目に、コンフルエント乳癌細胞株の細胞を2分間治療し、EDTAでは0.2、5%のトリップの2ミリリットルで治療する。細胞が剥離し始めると、完全な培地の6ミリリットルで反応を逮捕し、遠心分離によって細胞を沈下する。ペレットを5ミリリットルの新鮮な完全な培地に再び懸濁し、細胞を数え、完全な培地の1ミリリットル当たり1.5倍から5番目の細胞に希釈します。次に、6ウェルプレートで1ミリリットル当たりの5番目の細胞に1.5倍の10回を播種し、細胞培養インキュベーター内の細胞を一晩インキュベートする。または、ウイルス行GFPの導入を追加しません。翌朝、1~100マイクロリットルの12.5、25、および50マイクロリットルを10倍希釈して、1ミリリットル当たり10番目のプラーク形成単位に加え、ウイルス浸食GFP溶液を加えず、完全培地に添加する。適切なウェルまたは6ウェルプレートに加えて、それぞれ50、100、および200の感染多重度を有する細胞をトランスデュースする。すべてのサンプルのウェルズがウイルスで導入されたら、細胞を16〜24時間細胞培養インキュベーターに戻します。翌日、蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、上清を培地に置き換え、ウイルスを使用せずに細胞をさらに24時間回復させる。最適な伝達効率を決定するには、フローサイトメトリーにより細胞の蛍光強度と形態を評価します。バイオセーフティレベル2認定生物学的安全キャビネット内で、エアロゾルや飛沫からの感染を引き起こす可能性のあるすべての手順を必ず実施してください。細胞の酸化還元状態を評価するために、翌朝、細胞および6ウェルプレートの適切なウェルを1時間10マイクロモルモル過酸化水素でインキュベートし、EDTA当たり0.2 5%点滴の750マイクロリットルで細胞を剥離する前に、実証された。ウェルあたり完全な媒体の2ミリリットルで反応を停止し、個々の15ミリリットルの円錐管の各条件の上清を引っ張ります。遠心分離によって細胞を沈め、遠心分離によってPBSの500マイクロリットルでペレットを2回洗浄する。2回目の洗浄後、細胞懸濁液を40マイクロメートルメッシュでろ過し、氷上のフローサイトメトリー適合チューブにフィルターをかけます。フローサイトメーターソフトウェアで、感染制御サンプルのゼロ多重度を実行します。次に過酸化水素と未処理の細胞を分析します。これは、示された式を使用して、行GFPの酸化と減少形態の間の平均蛍光強度比の計算を可能にする。フローサイトメトリーにより多数の細胞を選択するための格言戦略を以下に示す。フローサイトメトリーは、行GFP分析のための線量応答曲線および感染入力の最も効率的な多重度を決定するためにも使用することができる。感染の多重度によれば、本代表分析における用量応答曲線は、200の多重度の感染が最も高い道路GFP発現を与えたが、細胞形態は細胞毒性を示唆する作用があった。そこで、最適な伝達効率は、100の感染の多重度であると判断した。このレドックス状態解析では、酸化および減少した行GFP平均蛍光強度は、車両および4つの10マイクロモル陽性対照過酸化水素処理のフローサイトメトリー分析から得られた。重ね合わせたヒストグラムは、過酸化水素10マイクロモルおよびビークル処理群の細胞数の変化を表すか、または減少して酸化された侵食GFPである。この分析のために酸化された行と減少した行GFPの比率を計算すると、10マイクロモル過酸化水素が車両処理と比較して行GFPの酸化の3倍の増加を引き起こしたことが明らかになった。正確なセル番号を持つことは、MRIの計算と再現性にとって重要です。再現性のある結果を得るためには、研究者は、均質な懸濁液を得るために徹底的に抗ウイルス溶液を混合する必要があります。このプロトコルは、研究者がリアルタイムで正常な細胞プロセスと疾患の進行の広い範囲の不可欠な部分として急速な酸化還元変化を研究することを可能にします。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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