Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

세포에서 사이토솔 특이적 roGFP를 표현하기 위한 구성 및 재조합 아데노바이러스는 각각 폴 T. 슈매커, 박사, 프레이버그 의과 대학, 노스웨스턴 대학 및 ViraQuest Inc.의 실험실에서 생성되었다. 이 연구는 NIH 국립 생물 의학 연구 우수성 센터 (COBRE NIGMS), 국립 일반 의료 시스템 약리학 및 독성학 교육 프로그램 보조금 T32 GM106999를 통해, 암 치료 보조금 P20GM109005에 호스트 반응의 연구 센터에 의해 지원되었다, UAMS 재단/의료 연구 인다우먼트 어워드 AWD00053956, UAMS 연말 총리 상 AWD00053484. 유동 세포측정 핵심 시설은 COBRE NIGMS를 통해 P20GM103625를 부여하는 미생물 병리학 및 호스트 염증 반응 센터에 의해 부분적으로 지원되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. ATA는 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 2214-A 장학금에 의해 지원되었다.

참고: 이 프로토콜은 70%-80% 컨실릭 MDA-MB-231 셀에 최적화되었습니다. 다른 세포주를 위해, 세포의 수 및 감염의 복합성 (MOI)는 재최적화되어야 합니다.
1. 세포 준비 (1 일)
<ol><li>MDA-MB-231 세포주를 75cm2 플라스크로 유지하여 10mL의 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)를 37°C에서 37°C로 보충하여 5%CO2 가습대기 대기시. 참고: DMEM은 10% FBS, 37°C, 및 5%CO2 가습대?...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

유기체의 티올/이황화물 균형은 세포의 레독스 상태를 반영한다. 살아있는 유기체는 글루타티온, 시스테인, 단백질 티올 및 저분자-중량 티올을 가지고 있으며, 모두 산화 수준에 의해 영향을 받고 세포4의레독스 상태를 에코한다. 엔지니어링 된 roGFP는 CyS 잔류물7을통해 티올 / 이황화물 균형의 파괴적 정량화를 허용합니다. roGFP의 비율 메트릭 특성은 포유류 ?...

산화 스트레스는 1985년 헬무트 시에 의해 "이전의 항산화제 균형에 대한교란"1로정의되었으며, 유기체 의 질병, 영양 및 노화 별 레독 스 상태를 얻기 위한 과다한 연구가 수행되었다1,,2,,3. 그 이후로 산화 스트레스에 대한 이해가 더 넓어지고 있습니다. 질병 및/또는 노화에 대한 항산화제를 사용하는 가설을 테스트하는 것은 산화 스트레스가 해를 끼칠 뿐만 아니라 세포에 다른 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 과학자들은 자유 래디칼이 신호 변환2에중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 모든 연구는 거대 분자의 감소 산화 (redox) 비율의 변화를 결정하는 중요성을 강화합니다. 효소 활성, 항산화제 및/또는 산화물 및 산화 제품은 다양한 방법으로 평가될 수 있습니다. 이들 중, 티올 산화를 결정하는 방법은 틀림없이 세포에 있는 산화방지제와 청록산제 사이 균형에 보고하기 때문에, 유기체4. 구체적으로, 글루타티온(GSH)/글루타티온 디설파이드(GSSG) 및/또는 시스테인(CyS)/시스테인(CySS)의 비율은 유기체2의레독스 상태를 모니터링하기 위한 바이오마커로 사용된다.
프로옥시드와 항산화제 사이의 균형을 말하는 데 사용되는 방법은 주로 세포 내의 감소/산화 단백질 또는 작은 분자 의 수준에 의존합니다. 서양 얼룩 및 질량 분광법은 감소/산화 된 거대 분자 (단백질, 지질 등)의 비율을 광범위하게 평가하는 데 사용되며 GSH / GSSG 비율은 분광성5로평가 될 수 있습니다. 이러한 방법의 일반적인 특징은 세포 리시스 및/또는 조직 균질화에 의한 시스템의 물리적 인 섭류입니다. 이 분석은 또한 다른 셀룰러 구획의 산화 상태를 측정할 필요가 있을 때 도전이 됩니다. 이러한 모든 혼란은 분석 환경에서 아티팩트를 유발합니다.
레독스에 민감한 형광 단백질은 세포 내 의 교란을 일으키지 않고 레독스 균형을 평가하기 위한 유리한 시대를 열었다6. 그(것)들은 셀룰러 세포 기관 사이 상호 토크를 조사하기 위하여 구획 특정 활동 (예를 들면, 미토콘드리아및 cytosol의 redox 상태를 말하는)의 정량화를 허용하는 다른 세포내 구획을 표적으로 할 수 있습니다. 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 HyPeR 단백질은 마이어와 동료6에의해 검토됩니다. 이러한 단백질 중, 레독스 에 민감한 GFP (roGFP)는 CyS (예: 488 nm/ em. 525 nm) 및 CySS (예. 405 nm / 525 nm) 잔류물의 다른 형광 판독으로 인해 독특하며, 이는 다른 홍옥에 민감한 단백질과는 달리 비율 메트릭 분석을7,허용합니다. 비율 측정 출력은 표현 수준, 검출 민감도 및 광표백8사이의 차이에 균형을 맞추기 때문에 유용합니다. 세포의 세포 형 구획 (사이토솔, 미토콘드리아, 핵) 또는 상이한 유기체 (박테리아 및 포유류 세포)는 roGFP7,,9,,10을수정하여 표적으로 할 수 있다.
roGFP 의 소법은 특히 실시간 시각화 실험을 위해 형광 이미징 기술을 사용하여 수행됩니다. roGFP의 흐름 세포 측정 분석은 미리 정해진 시간 점을 가진 실험에도 가능합니다. 현재 문서는 형광 현미경 검사법과 유동 세포측정법의 사용이 모두 설명되어 아데노바이러스 형질 전염을 통해 roGFP (cytosol 표적)를 과발현하는 포유류 세포에서 백강체 상태의 비율 메트릭 평가를 수행합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

세포 내 산화/감소 균형을 측정하면 유기체의 생리학적 및/또는 병리학적 레독 상태에 대한 개요를 제공합니다. 티올은 감소된 디티올 과 산화 된 이황화물 비율을 통해 세포의 레독스 상태를 조명하는 데 특히 중요합니다. 엔지니어링 된 시스테인 함유 형광 단백질은 레독스에 민감한 바이오 센서의 새로운 시대를 열어주습니다. 그 중 하나인 레독스에 민감한 녹색 형광 단백질(roGFP)은 아데노바이러스 트랜스듀싱을 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있어 세포 과정을 방해하지 않고 세포구획의 레독스 상태를 평가할 수 있습니다. 감소된 시스테인과 roGFP의 산화 된 낭포진은 각각 488 nm와 405 nm에서 흥분 최대가 있으며 525 nm에서 방출됩니다. 이러한 감소 및 산화 형태의 비율을 평가하면 셀 내의 레독스 균형을 편리하게 계산할 수 있습니다. 이 방법 문서에서는, 불멸의 인간 삼중 음성 유방암 세포 (MDA-MB-231)는 살아있는 세포 내의 레독스 상태를 평가하기 위하여 이용되었다. 프로토콜 단계는 세포성 roGFP를 발현하기 위하여 아데노바이러스를 가진 MDA-MB-231 세포주 변환, H2O2를가진 처리 및 유동 세포질 및 형광 현미경 검사법을 가진 시스테인 및 cystine 비율의 평가를 포함합니다.

CyS/CySS의 레독스 상태는 변환된 roGFP로 쉽게 분석됩니다. 형광 프로브는 감소된 형태와 산화 형태 사이의 비율을 정량화한다(각성 파장 488nm 및 405 nm, 각각). 형광 데이터는 유동 세포측정및 현미경 검사법 모두에 의해 얻어질 수 있다.
많은 수의 세포가 유동 세포측정을 사용하여 일관되고 편리하게 습득할 수 있습니다. 분석은 3개의 주요 단계로 이루어져 있습니다: 1) FSC 영역 ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

섬유의 현재 프로토콜 평가자, 레독스 상태는 세포내 구획 별 방식으로 변경됩니다. 우리의 프로토콜은 산화 스트레스의 모든 생리적 또는 병리학 적 메커니즘을 더 잘 이해하고 모니터링 할 수 있습니다. 이 기술은 비비율 메트릭 출력을 사용하여 그대로 세포에서 타일 눈 황화물 비율의 비파괴 적정화를 허용하여 신호 발현 수준, 사진 표백 및 검출 민감도 사이의 차이를 상쇄할 수 있습니다.이 프로토콜은 식물에 있는 박테리아를 포함하여 각종 유기체에 적용될 수 있습니다. 실험의 첫날에 2 분 동안 동천성 유방암 세포주에서 세포를 치료하고, EDTA에서 0.2, 5 %의 2 밀리리터를 가진다. 세포가 분리되기 시작하면 완전한 배지및 퇴적물의 6밀리리터로 세포를 원심분리에 의한 반응을 체포한다.신선한, 완전한 매체의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 세포를 계산하고 완전한 매체의 1 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 1.5 배 10으로 희석합니다. 그런 다음 6웰 플레이트에서 잘 세포의 밀리리터 당 5 번째 세포당 1.5 배 10을 시드하고, 하룻밤 동안 세포 배양 배양에서 세포를 배양한다. 또는 바이러스 성 행 GFP 변환을 추가하지 않습니다.다음 아침, 12.5, 25 및 50 마이크로리터를 1-100의 마이크로리터를 10번 10번 희석하여 밀리리터당 10번째 플라크 성형 유닛에 완전한 배지에 바이러스 침식 GFP 용액을 첨가하지 않는다. 각각 50, 100 및 200 복합 감염으로 세포를 변환하기 위해 적절한 우물 또는 6 웰 플레이트에 추가합니다. 모든 샘플 웰스가 바이러스로 변환되면 세포를 세포 배양 인큐베이터로 16~24시간 동안 되돌려 보입니다.다음 날, 형광 현미경 검사법에 의해 세포를 시각화하고 세포가 추가 24 시간 동안 복구 할 수 있도록 바이러스없이, 매체로 상체를 대체. 최적의 유도 효율을 결정하기 위해 세포측정을 유동하여 세포의 형광 강도 및 형태학을 평가합니다. 생물 안전 수준 2 인증 생물학적 안전 캐비닛 내에서 에어로졸 또는 스플래시에서 감염을 일으킬 수있는 모든 절차를 수행해야합니다.세포의 레독스 상태를 평가하기 위해, 다음 아침, 1시간 동안 10 마이크로몰라 수소와 함께 6웰 플레이트의 세포와 적절한 우물을 배양한 후 EDTA에서 0.2 5%의 750 마이크로리터로 세포를 분리하는 것으로 입증되었다. 잘 당 완전한 매체의 두 밀리리터와 반응을 중지하고 개별 15 밀리리터 원판 튜브에서 각 조건에 대한 슈퍼 나츠를 당깁니다. 원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 500마이크로리터의 PBS를 두 번 원심분리하여 잘 씻어낸다.두 번째 세척 후, 40 마이크로 미터 의 메스를 통해 세포 현탁액을 빛으로부터 보호된 얼음의 유세포 측정 호환 튜브로 필터링합니다. 흐름 사이토미터 소프트웨어에서 감염 제어 샘플의 0 복합성을 실행합니다. 그런 다음 과산화수소 및 처리되지 않은 세포를 분석합니다.표시된 바와 같이 수식을 사용하여 산화된 행 GFP 의 감소된 형태 사이의 평균 형광 강도 비율을 계산할 수 있습니다. 다음은 유동 세포측정에 의한 다수의 세포를 선택하기 위한 게이팅 전략이 도시된다. 유동 세포측정은 또한 행 GFP 분석에 대한 용량 반응 곡선과 감염 입력의 가장 효율적인 복합성을 결정하는 데 사용될 수 있다.감염의 복합성에 따르면, 이 대표적인 분석에서 투여량 반응 곡선, 감염의 200 복합성은 가장 높은 도로 GFP 발현을 주었지만, 세포 형태는 세포 독성을 시사하는 효과가 있었다. 따라서 최적 전환 효율은 100의 감염의 복합성으로 결정되었다. 이러한 레독스 상태 분석에서, 산화 및 감소행 GFP는 차량에 대한 유동 세포측정 분석에서 형광 강도를 획득하고 4개의 10마이크로몰러 양성 제어 과산화수소 치료제를 얻었다.중첩 된 히스토그램은 과산화수소 10 마이크로 몰라 및 차량 처리 그룹 또는 감소 및 산화 침식 GFP에서 세포 수의 변화를 나타냅니다. 이 분석을 위해 산화 및 감소행 GFP 사이의 비율을 계산한 결과, 과산화수소 10개가 차량 처리에 비해 행 GFP의 산화를 3배 증가시킨 것으로 나타났다. 정확한 셀 번호를 갖는 것은 MRI 계산 및 재현성에 중요합니다.재현 가능한 결과를 얻으려면 연구자들은 항 바이러스 솔루션을 철저히 혼합하여 균일한 현탁액을 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 연구원이 정상 세포 프로세스및 질병 진행의 광범위한 부분의 필수적인 부분으로 급속한 redox 변경을 실시간으로 연구할 수 있게 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

추출 및 대만 그린 프로 폴리스의 분석

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...