Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Konstruksjonen og rekombinant adenovirus for å uttrykke cytosol-spesifikk roGFP i celler ble generert i laboratoriet til Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, og ViraQuest Inc., henholdsvis. Denne studien ble støttet av Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 gjennom NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation / Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. Flow cytometri kjerne anlegget ble støttet delvis av Center for Microbial Pathogenesis og Host Inflammatory Responses gi P20GM103625 gjennom COBRE NIGMS. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til NIH. ATA ble støttet av The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2214-A stipend.

MERK: Denne protokollen ble optimalisert for 70 %–80 % sammenføyning av MDA-MB-231-celler. For andre cellelinjer bør antall celler og mangfold av infeksjon (MOI) reoptimeres på nytt.
1. Utarbeidelse av celler (dag 1)
<ol><li>Vedlikehold MDA-MB-231 cellelinje i 75 cm2 flasker med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% fostervin serum (FBS) ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet atmosfære. MERK: DMEM supplert med 10 % FBS, 37 °C og en 5 % CO<sub...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

Tiol/disulfidbalansen i kroppen reflekterer rødoksstatusen til celler. Levende organismer har glutation, cystein, proteintioler og lavmolekylærvekttioler, som alle påvirkes av oksidasjonsnivået og ekko redoksstatusen til celler4. Konstruerte roGFPs tillater ikke-forstyrrende kvantifisering av tiol/disulfidbalansen via cysestene7. Den forholdsmetriske egenskapen til roGFP gir pålitelige redoksmålinger for pattedyrceller. roGFP kan enkelt introduseres i celler med trans...

Oksidativt stress ble definert i 1985 av Helmut Sies som "en forstyrrelse i prooksidant-antioksidantbalanse i favør av den tidligere"1, og en mengde forskning har blitt utført for å oppnå sykdom-, ernæring-, og aldringsspesifikk redoksstatus avorganismer 1,2,3. Siden da har forståelsen av oksidativt stress blitt bredere. Testing av hypotesene ved å bruke antioksidanter mot sykdommer og/ eller aldring har vist at oksidativt stress ikke bare forårsaker skade, men har også andre roller i celler. Videre har forskere vist at frie radikaler spiller en viktig rolle for signaltransduksjon2. Alle disse studiene styrker viktigheten av å bestemme endringene i reduksjonsoksidasjonsforholdet (redoks) av makromolekyler. Enzymaktivitet, antioksidanter og/eller oksidanter og oksidasjonsprodukter kan vurderes med ulike metoder. Blant disse er metoder som bestemmer tioloksidasjon uten tvil den mest brukte fordi de rapporterer om balansen mellom antioksidanter og prooksidanter i celler, samtorganismer 4. Spesielt brukes forhold mellom glutation (GSH)/glutationdisulfid (GSSG) og/eller cystein (CyS)/cystin (CySS) som biomarkører for overvåking av redoksstatusen tilorganismer 2.
Metoder som brukes til å analysere balansen mellom prooksidanter og antioksidanter, er hovedsakelig avhengig av nivåene av reduserte/oksiderte proteiner eller små molekyler i celler. Vestlige blots og massespektrometri brukes til å bredt vurdere forholdet mellom reduserte / oksiderte makromolekyler (protein, lipider etc.), og GSH / GSSG-forhold kan vurderes med spektrofotometri5. Et vanlig trekk ved disse metodene er den fysiske perturbasjonen av systemet ved cellelysis og / eller vev homogenisering. Disse analysene blir også utfordrende når det er nødvendig å måle oksidasjonsstatusen til forskjellige cellulære rom. Alle disse perturbasjonene forårsaker artefakter i analysemiljøet.
Redox-sensitive fluorescerende proteiner åpnet en fordel for evaluering av redoksbalansen uten å forårsake forstyrrelser i cellene6. De kan målrette mot ulike intracellulære rom, slik at kvantifisering av kupéspesifikke aktiviteter (f.eks. analysere redokstilstanden til mitokondrier og cytosol) for å undersøke krysstale mellom cellulære organeller. Gult fluorescerende protein (YFP), grønt fluorescerende protein (GFP) og HyPeR-proteiner gjennomgås av Meyer og kolleger6. Blant disse proteinene er redoksfølsomme GFP (roGFP) unike på grunn av forskjellige fluorescerende avlesninger av cys (f. 488 nm/em. 525 nm) og CySS (f.eks. 405 nm/525 nm) rester, som tillater ratiometrisk analyse, i motsetning til andre redoks-sensitive proteiner som YFP7,8. Ratiometrisk utdata er verdifull fordi den motvekter forskjellene mellom uttrykksnivåer, deteksjonsfølsomheter og fotobleking8. Subcellulære celleavdelinger (cytosol, mitokondrier, kjerne) eller forskjellige organismer (bakterier samt pattedyrceller) kan målrettes ved å endre roGFP7,,9,,10.
roGFP-analyser utføres ved hjelp av fluorescerende bildeteknikker, spesielt for visualiseringseksperimenter i sanntid. Flow cytometriske analyser av roGFPs er også mulig for eksperimenter med forhåndsbestemte tidspunkter. Den nåværende artikkelen beskriver både bruk av fluorescerende mikroskopi og strømningscytometri for å utføre en ratiometrisk vurdering av redoksstatus hos pattedyrceller som overexpressing roGFP (målrettet mot cytosol) via adenoviral transduging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

Måling av den intracellulære oksidasjons-/reduksjonsbalansen gir en oversikt over organismens fysiologiske og/eller patofysiologiske redoksstatus. Tioler er spesielt viktige for å belyse redoksstatusen til celler via deres reduserte dithiol og oksiderte disulfidforhold. Konstruerte cysteinholdige fluorescerende proteiner åpner en ny æra for redoksfølsomme biosensorer. En av dem, redoks-sensitive grønne fluorescerende protein (roGFP), kan lett innføres i celler med adenoviral transduksjon, slik at redoksstatusen til subcellulære rom kan evalueres uten å forstyrre cellulære prosesser. Redusertcysteiner og oksiderte cystiner av roGFP har eksitasjon maxima på henholdsvis 488 nm og 405 nm, med utslipp på 525 nm. Vurdering av forholdet mellom disse reduserte og oksiderte formene gjør det mulig å beregne redoksbalansen i cellen. I denne metodeartikkelen ble udødeliggjorte humane trippelnegative brystkreftceller (MDA-MB-231) brukt til å vurdere redoksstatus i den levende cellen. Protokollen trinnene inkluderer MDA-MB-231 cellelinje transduksjon med adenovirus å uttrykke cytosolic roGFP, behandling med H2O2,og vurdering av cystein og cystin forhold med både strømning cytometri og fluorescens mikroskopi.

Redokstilstanden til CyS/CySS analyseres lett med transdusert roGFPs. Den fluorescerende sonden kvantifiserer forholdet mellom de reduserte og oksiderte formene (eksitasjonsbølgelengder henholdsvis 488 nm og 405 nm). Fluorescensdata kan innhentes ved både strømningscytometri og mikroskopi.
Et stort antall celler kan konsekvent og praktisk anskaffes ved hjelp av strømningscytometri. Analysen består av 3 hovedtrinn: 1) velg cellepopulasjonen av interesse med FSC-områdefilteret (<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Denne protokollen beskriver vurderingen av subcellulær romspesifikk redoksstatus i cellen. En redoksfølsom fluorescerende sonde gir praktisk ratiometrisk analyse i intakte celler.

Vurdering av cellulær oksidasjon ved hjelp av et subcellulært romspesifikt Redox-Sensitive Green Fluorescerende protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Nåværende protokoll assessors i tekstil, redox tilstand endres på en intracellulær rom-spesifikk måte. Vår protokoll gir en bedre forståelse og overvåking av alle fysiologiske eller patofysiologiske mekanismer for oksidativt stress. Denne teknikken tillater ikke-forstyrrende kvantifisering av flislagt øyesulfidforholdet i intakte celler ved hjelp av et forhold metrisk utgang for å motvirke forskjellene mellom signaluttrykksnivåer, fotobleking og deteksjonsfølsomheter.Denne protokollen kan brukes på ulike organismer, inkludert bakterier i planter. På dag en av forsøket behandle cellene fra en samtidig brystkreft cellelinje i to minutter, med to milliliter på 0,2, 5% turer i EDTA. Når cellene begynner å løsne arresteringen, arresterer reaksjonen med seks milliliter med komplett medium og sediment cellene ved sentrifugering.Re suspendere pellet i fem milliliter av frisk, komplett medium, telle cellene og fortynne dem til 1,5 ganger 10 til femte celler per en milliliter av komplett medium. Deretter frø 1,5 ganger 10 til de femte cellene per milliliter celler per brønn i en 6 brønnplate, og inkubere cellene i cellekulturinkubatoren over natten. Eller legg til ingen viral rad GFP-transduksjon.Neste morgen, legg til 12,5, 25 og 50 mikroliter av en en til 100 fortynnet seks ganger 10 til 10th plakk forming enheter per milliliter legge ingen viral erode GFP løsning, i komplett medium. Legg det til de aktuelle brønnene eller 6-brønnplaten for å transdusere cellene med henholdsvis 50, 100 og 200 infeksjonsmultiplikasjoner. Når alle prøvebrønnene er transdusert med virus, returnerer cellene til cellekulturinkubatoren i 16 til 24 timer.Neste dag visualiser cellene ved fluorescensmikroskopi og erstattet supernatanten med medium, uten virus for å tillate cellene å gjenopprette i ytterligere 24 timer. For å bestemme den optimale transduksjonseffektiviteten, vurder fluorescensintensiteten og morfologien til cellene ved strømningscytometri. Sørg for å utføre alle prosedyrene som kan forårsake infeksjon fra aerosoler eller sprut innenfor et biosikkerhetsnivå to sertifisert biologisk sikkerhetsskap.For å vurdere redoksstatusen til cellene, neste morgen, inkubere cellene og de riktige brønnene til 6-brønnplaten med 10 mikromos hydrogenperoksid i en time, før de løsner cellene med 750 mikroliter på 0,2 5% drypp i EDTA per brønn, som demonstrert. Stopp reaksjonen med to milliliter komplett medium per brønn og trekk supernativa for hver tilstand i individuelle 15 milliliter koniske rør. Sediment cellene ved sentrifugering og vask pellets i 500 mikroliter PBS per brønn ved sentrifugasjoner to ganger.Etter den andre vasken filtrerer du cellesuspensjonene gjennom 40 mikromålernett til strømningscytometrikompatible rør på is, beskyttet mot lys. I Flow cytometer programvare, kjøre null multiplisitet av infeksjon kontroll prøven. Analyser deretter hydrogenperoksid og ubehandlede celler.Det vil tillate beregning av gjennomsnittlig fluorescerende intensitetsforhold mellom oksidert versus reduserte former for rad GFP, ved hjelp av formelen som angitt. Her er gating strategi for å velge et stort antall celler ved flyt cytometri vises. Flow cytometri kan også brukes til å bestemme doseresponskurven for rad GFP analyse og den mest effektive mangfoldet av infeksjon inngang.Ifølge mangfoldet av infeksjon, dose responskurve i denne representative analysen, en 200 mangfold av infeksjon ga den høyeste veien GFP uttrykk, men celle morfologi ble påvirket tyder cytotoksisitet. Derfor ble den optimale transduksjonseffektiviteten fastslått å være et mangfold av infeksjon på 100. I denne redoksstatusanalysen ble oksidert og redusert rad GFP gjennomsnittlig fluorescensintensitet hentet fra strømningscytometrianalyse for kjøretøy og fire 10 mikromolarpositive kontroll hydrogenperoksidbehandlinger.De overlaid histogrammer representerer endringene i cellenummeret i 10 mikromolar hydrogenperoksid og kjøretøy behandlet grupper eller redusert og oksidert erodere GFP. Beregning av forholdet mellom oksidert og redusert rad GFP for denne analysen viste at 10 mikromos hydrogenperoksid forårsaket en tredobling i oksidasjon av rad GFP sammenlignet med kjøretøybehandlingen. Å ha nøyaktige celletall er viktig for MR-beregninger og reproduserbarhet.For å få reproduserbare resultater, bør forskerne grundig blande antivirale løsninger for å oppnå homogene suspensjoner. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å studere raske redoksendringer som en integrert del av det brede spekteret av normale cellulære prosesser og sykdomsprogresjon i sanntid.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infrarød elektrokjemi demonstrert for studier av H2 oksidasjon av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Utvinning og analyse av taiwanske grønne Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...