Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
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O adenovírus construto e recombinante para a expressão de roGFP específico para citosol em células foram gerados no laboratório de Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University e ViraQuest Inc., respectivamente. Este estudo foi apoiado pelo Centro de Estudos de Resposta ao Câncer P20GM109005 através do INSTITUTO Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH Centros de Excelência em Pesquisa Biomédica (COBRE NIGMS), Instituto Nacional de Clínicas Médicas Gerais Programa de Pharnacologia e Treinamento toxicológico conceder T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. A instalação do núcleo de citometria de fluxo foi apoiada em parte pelo Centro de Patogênese Microbiana e Respostas Inflamatórias hospedeiras que concedem P20GM103625 através do COBRE NIGMS. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH. A ATA foi apoiada pela bolsa de estudos 2214-A do Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK).

NOTA: Este protocolo foi otimizado para células MDA-MB-231 confluentes de 70%-80%. Para outras linhas celulares, o número de células e a multiplicidade de infecção (MOI) devem ser reotimizados.
1. Preparação de células (dia 1)
<ol><li>Mantenha a linha celular MDA-MB-231 em frascos de 75 cm2 com 10 mL do meio Eagle modificado (DMEM) modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO2. NOTA: DME...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

O equilíbrio tiol/dissulfeto em um organismo reflete o estado redox das células. Organismos vivos têm glutationa, cisteína, tialis proteicos e tiols de baixo peso molecular, todos afetados pelo nível de oxidação e ecoam o estado redox das células4. RoGFPs projetados permitem a quantificação sem interrupções do equilíbrio thiol/dissulfeto através de seus resíduos CyS7. A propriedade racionmétrica do roGFP fornece medições de redox confiáveis para células ...

O estresse oxidativo foi definido em 1985 por Helmut Sies como "uma perturbação no equilíbrio prooxidante-antioxidante em favor do primeiro"1, e uma infinidade de pesquisas foi conduzida para obter o estado de redox específico da doença, nutrição e envelhecimento dos organismos1,,2,,3. Desde então, a compreensão do estresse oxidativo tornou-se mais ampla. Testar as hipóteses do uso de antioxidantes contra doenças e/ou envelhecimento mostrou que o estresse oxidativo não só causa danos, mas também tem outros papéis nas células. Além disso, os cientistas mostraram que os radicais livres desempenham um papel importante para a transdução de sinais2. Todos esses estudos reforçam a importância de determinar as mudanças na razão de redução-oxidação (redox) das macromoléculas. A atividade enzimápica, antioxidantes e/ou oxidantes e produtos de oxidação podem ser avaliados com vários métodos. Entre estes, os métodos que determinam a oxidação do tiol são indiscutivelmente os mais utilizados porque relatam o equilíbrio entre antioxidantes e prooxidantes nas células, bem como organismos4. Especificamente, as relações entre glutationa (GSH)/glutatione dissulfeto (GSSG) e/ou cisteína (CyS)/cystine (CySS) são usadas como biomarcadores para monitorar o estado redox dos organismos2.
Os métodos utilizados para avaliar o equilíbrio entre prooxidantes e antioxidantes dependem principalmente dos níveis de proteínas reduzidas/oxidadas ou pequenas moléculas dentro das células. Manchas ocidentais e espectrometria de massa são usadas para avaliar amplamente as proporções de macromoléculas reduzidas/oxidadas (proteínas, lipídios etc.), e as razões GSH/GSSG podem ser avaliadas com espectrofotometria5. Uma característica comum desses métodos é a perturbação física do sistema por lise celular e/ou homogeneização tecidual. Essas análises também se tornam desafiadoras quando é necessário medir o estado de oxidação de diferentes compartimentos celulares. Todas essas perturbações causam artefatos no ambiente de ensaio.
Proteínas fluorescentes sensíveis ao redox abriram uma era vantajosa para avaliar o equilíbrio redox sem causar perturbação nas células6. Eles podem atingir diferentes compartimentos intracelulares, permitindo a quantificação de atividades específicas do compartimento (por exemplo, o que diz respeito ao estado redox das mitocôndrias e do citosol) para investigar o crosstalk entre organelas celulares. Proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente verde (GFP) e proteínas HyPeR são revisadas por Meyer e colegas6. Entre essas proteínas, o GFP sensível ao redox (roGFP) é único devido a diferentes leituras fluorescentes de seus resíduos CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) e CySS (ex. 405 nm/525 nm), que permitem análise ratiométrica, ao contrário de outras proteínas sensíveis à redox, como YFP7,8. A saída racionada é valiosa porque contrabalança as diferenças entre os níveis de expressão, sensibilidades de detecção e fotobleaching8. Compartimentos subcelulares de células (citoso, mitocôndrias, núcleo) ou organismos diferentes (bactérias, bem como células mamíferas) podem ser alvo modificando roGFP7,,9,10.
Os ensaios roGFP são conduzidos utilizando técnicas de imagem fluorescente, especialmente para experimentos de visualização em tempo real. Análises citométricas de fluxo de roGFPs também são possíveis para experimentos com pontos de tempo predeterminados. O artigo atual descreve tanto o uso de microscopia fluorescente quanto a citometria de fluxo para realizar uma avaliação ratiométrica do estado de redox em células de mamíferos superexpressando roGFP (direcionado para citosol) via transdução adenoviral.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

A medição do equilíbrio de oxidação/redução intracelular fornece uma visão geral do estado fisiológico e/ou fisiofisiológico de um organismo. Os tiais são especialmente importantes para iluminar o status de redox das células através de suas relações reduzidas de dithiol e dissulfeto oxidado. Proteínas fluorescentes que contêm cisteína projetadas abrem uma nova era para biosensores sensíveis ao redox. Uma delas, a proteína fluorescente verde sensível ao redox (roGFP), pode ser facilmente introduzida em células com transdução adenoviral, permitindo que o status de redox dos compartimentos subcelulares seja avaliado sem interromper os processos celulares. Cisteínas reduzidas e cistinos oxidados de roGFP têm máxima de excitação em 488 nm e 405 nm, respectivamente, com emissão de 525 nm. Avaliar as proporções dessas formas reduzidas e oxidadas permite o cálculo conveniente do equilíbrio de redox dentro da célula. Neste artigo de método, foram utilizadas células cancerígenas de mama humanas triplas-negativas (MDA-MB-231) para avaliar o estado de redox dentro da célula viva. As etapas do protocolo incluem transdução de linha celular MDA-MB-231 com adenovírus para expressar roGFP citosomico, tratamento com H2O2, e avaliação da razão cisteína e cistina com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

O estado redox de CyS/CySS é facilmente avaliado com roGFPs transduzidas. A sonda fluorescente quantifica a razão entre as formas reduzidas e oxidadas (comprimentos de onda de excitação 488 nm e 405 nm, respectivamente). Os dados de fluorescência podem ser obtidos tanto por citometria de fluxo quanto por microscopia.
Um grande número de células pode ser adquirida de forma consistente e conveniente usando citometria de fluxo. A análise consiste em 3 etapas principais: 1) selecionar a po...

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Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Este protocolo descreve a avaliação do status de redox específico do compartimento subcelular dentro da célula. Uma sonda fluorescente sensível ao redox permite uma análise racionmétrica conveniente em células intactas.

Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Os atuais assessores de protocolo em têxteis, redox estado muda de forma intracelular com compartimento específico. Nosso protocolo permite uma melhor compreensão e monitoramento de todos os mecanismos fisiológicos ou fisiofisiológicos do estresse oxidativo. Esta técnica permite quantificação sem interrupções da relação de sulfeto de olho em células intactas usando uma saída métrica de razão para contrabalançar as diferenças entre níveis de expressão de sinal, branqueamento de fotos e sensibilidades de detecção.Este protocolo pode ser aplicado a vários organismos, incluindo bactérias em plantas. No primeiro dia do experimento, o experimento tratou as células de uma linha de células cancerígenas de mama confluentes por dois minutos, com dois mililitros de 0,2, 5% de viagens em EDTA. Quando as células começam a se desprender, desprendem a reação com seis mililitros de meio completo e sedimentos as células por centrifugação.Suspender a pelota em cinco mililitros de meio fresco e completo, contar as células e diluí-las para 1,5 vezes 10 para as quintas células por um mililitro de meio completo. Em seguida, semente 1,5 vezes 10 para a quinta células por mililitro de células por poço em uma placa de 6 poços, e incubar as células na incubadora de cultura celular durante a noite. Ou não adicionar transdução de linha viral GFP.Na manhã seguinte, adicione 12,5, 25 e 50 microliters de um a 100 diluídos seis vezes 10 à 10ª placa formando unidades por mililitro de adicionar nenhuma solução GFP de corrosão viral, em meio completo. Adicione isso aos poços apropriados ou à placa de 6 poços para transduzir as células com 50, 100 e 200 multiplicidades de infecção, respectivamente. Quando todas as amostras de Wells tiverem sido transduzidas com vírus, devolva as células à incubadora de cultura celular por 16 a 24 horas.No dia seguinte, visualize as células por microscopia de fluorescência e substitua o supernascer por médio, sem vírus para permitir que as células se recuperem por mais 24 horas. Para determinar a eficiência ideal de transdução, avalie a intensidade da fluorescência e a morfologia das células por citometria de fluxo. Certifique-se de conduzir todos os procedimentos que podem causar infecção de aerossóis ou respingos dentro de um armário de segurança biológica certificado de biossegurança dois.Para avaliar o estado de redox das células, na manhã seguinte, incubar as células e os Poços apropriados da placa de 6 poços com 10 peróxido de hidrogênio micromolar por uma hora, antes de desacoplar as células com 750 microlitres de 0,2 5% gotejamentos em EDTA por bem, como demonstrado. Pare a reação com dois mililitros de meio completo por poço e puxe os supernantes para cada condição em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação e lavar as pelotas em 500 microlitadores de PBS por bem por centrífugas duas vezes.Após a segunda lavagem, filtre as suspensões celulares através de malhas de 40 micrometros em tubos compatíveis com citometria de fluxo no gelo, protegidos da luz. No software do citómetro Flow, execute a multiplicidade zero da amostra de controle de infecções. Em seguida, analise o peróxido de hidrogênio e células não tratadas.Permitirá o cálculo da relação média de intensidade fluorescente entre as formas oxidadas versus reduzidas de RSG de linha, utilizando a fórmula conforme indicado. Aqui está a estratégia de gating para selecionar um grande número de células por citometria de fluxo é mostrada. A citometria de fluxo também pode ser usada para determinar a curva de resposta da dose para análise de GFP de linha e a multiplicidade mais eficiente de entrada de infecção.De acordo com a multiplicidade de infecção, curva de resposta de dose nesta análise representativa, uma multiplicidade de 200 infecções deu a maior expressão de GFP rodoviário, mas a morfologia celular foi efetuada sugerindo citotoxicidade. Portanto, a eficiência de transdução ideal foi determinada como uma multiplicidade de infecção de 100. Nesta análise de status redox, foram obtidas intensidades médias de fluorescência de gfp de linha oxidada e reduzida a partir da análise de citometria de fluxo para o veículo e quatro tratamentos de peróxido de hidrogênio de controle positivo de 10 micromolar.Os histogramas sobrepostos representam as mudanças no número de células nos 10 grupos de peróxido de hidrogênio micromolar e veículos tratados ou gfp de erode reduzida e oxidada. O cálculo da razão entre o GFP oxidado e a linha reduzida para esta análise revelou que 10 peróxido de hidrogênio micromolar causaram um aumento triplo na oxidação do GFP de linha em comparação com o tratamento do veículo. Ter números de células precisos é importante para cálculos de ressonância magnética e reprodutibilidade.Para obter resultados reprodutíveis, os pesquisadores devem misturar completamente as soluções antivirais para obter suspensões homogêneas. Este protocolo permite que os pesquisadores estudem mudanças rápidas de redox como parte integrante da ampla gama de processos celulares normais e da progressão da doença em tempo real.

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