Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Конструкция и рекомбинантный аденовирус для выражения цитозолоспецифического roGFP в клетках были созданы в лаборатории Пола Т. Шумакера, PhD, Школы медицины Фрайберга, Северо-Западного университета и Vira'uest Inc., соответственно. Это исследование было поддержано Центром исследований принимающей ответ на рак терапии грант P20GM109005 через NIH Национальный институт общих медицинских наук Центры биомедицинских исследований Excellence (COBRE NIGMS), Национальный институт общих медицинских наук систем фармакологии и токсикологии Учебная программа грант T32 GM106999, Фонд UAMS/Медицинский исследовательский фонд премии AWD00053956, UAMS Год-Конец канцлера Награды AWD00053484. Ядро потока цитометрии ядро было поддержано в части Центра микробных патогенеза и принимающих воспалительных реакций грант P20GM103625 через COBRE NIGMS. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения НИЗ. ATA была поддержана Советом по научно-техническим исследованиям Турции (TUBITAK) 2214-A стипендией.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для 70%-80% слияния MDA-MB-231 ячеек. Для других клеточных линий, количество клеток и множественность инфекции (MOI) должны быть reoptimized.
1. Подготовка клеток (день 1)
<ol><li>Поддержание MDA-MB-231 клеточной линии в 75 см2 фляги с 10 мЛ модифици?...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

Тиол/дисульфидный баланс в организме отражает состояние редокса клеток. В живых организмах есть глутатион, цистеин, белковые тиолы и низкомолекулярные тиолы, все из которых зависят от уровня окисления и повторяют редоксовый статус клеток4. Инженерные roGFPs позволяют ненару?...

Окислительный стресс был определен в 1985 году Гельмут Сис как "нарушение в прооксидант-антиоксидантный баланс в пользупервого" 1, и множество исследований было проведено для получения болезни, питания, и старения конкретных редокс статус организмов1,2,3. С тех пор понимание окислительного стресса стало шире. Тестирование гипотез использования антиоксидантов против болезней и/или старения показало, что окислительный стресс не только причиняет вред, но и имеет другие роли в клетках. Кроме того, ученые показали, что свободные радикалы играют важную роль для переноса сигнала2. Все эти исследования усиливают важность определения изменений в соотношении макромолекулов. Активность ферментов, антиоксиданты и/или окислители, а также продукты окисления могут быть оценены различными методами. Среди них, методы, которые определяют окисление тиола, возможно, наиболее часто используются, потому что они сообщают о балансе между антиоксидантами и прооксидантами в клетках, а также организмов4. В частности, в качестве биомаркеров для мониторинга состояния редокса организмов2используются соотношения между глутатионе (GSH)/глутатион дисульфид (ГСГ) и/или цистеином (CySS).
Методы, используемые для анализа баланса между прооксидантами и антиоксидантами, полагаются главным образом на уровни пониженных/окислимых белков или мелких молекул в клетках. Западные помарки и масс-спектрометрия используются для широкой оценки соотношения уменьшенных/окислимых макромолекул (белков, липидов и т.д.), а коэффициенты GSH/GSSG можно оценить с помощью спектрофотометрии5. Общей чертой этих методов является физическое возмущение системы клеточным лизисом и/или гомогенизацией тканей. Эти анализы также становятся сложными, когда необходимо измерить состояние окисления различных клеточных отсеков. Все эти возмущения вызывают артефакты в среде анализа.
Редокс чувствительных флуоресцентных белков открыл выгодную эру для оценки баланса redox, не вызывая нарушения в клетках6. Они могут быть нацелены на различные внутриклеточные отсеки, что позволяет количественно определить отдельные действия (например, анализ состояния редокса митохондрий и цитозола) для исследования перекрестного разговора между клеточными органеллами. желтый флуоресцентный белок (YFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и белки HyPeR рассматриваются Мейером и коллегами6. Среди этих белков, редокс чувствительных GFP (roGFP) является уникальным из-за различных флуоресцентных считываний его CyS (например, 488 нм/em. 525 нм) и CySS (например, 405 нм/525 нм) остатки, что позволяет коэффициентический анализ, в отличие от других редокс чувствительных белков, таких как YFP7,8. Коэффициентометрический выход ценен тем, что уравновешивает различия между уровнями выражения, чувствительностью обнаружения и фотосъемки8. Подклеточные отсеки клеток (цитозол, митохондрии, ядра) или различных организмов (бактерий, а также клеток млекопитающих) могут быть направлены путем изменения roGFP7,9,10.
анализы roGFP проводятся с использованием методов флуоресцентной визуализации, особенно для экспериментов по визуализации в режиме реального времени. Цитометрический анализ цитометрических факторов roGFP также возможен для экспериментов с заранее определенными временными точками. Текущая статья описывает как использование флуоресцентной микроскопии и цитометрии потока для выполнения коэффициентной оценки состояния редокса в клетках млекопитающих, переэкспрессионных roGFP (направленных на цитосол) с помощью аденовирусной трансдукции.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

Измерение внутриклеточного окисления/снижения баланса обеспечивает обзор физиологического и/или патофизиологического редокса состояние организма. Тиолы особенно важны для освещения состояния редокса клеток через их снижение дитиола и окислимых коэффициентов дисульфида. Инженерные цистеин-содержащие флуоресцентные белки открывают новую эру для редокс чувствительных биосенсоров. Один из них, редокс чувствительных зеленый флуоресцентный белок (roGFP), может быть легко введен в клетки с аденовирусной трансдукции, что позволяет редокс статус субклеточных отсеков, которые будут оцениваться без нарушения клеточных процессов. Снижение цистеин и окислившиеся цистины roGFP имеют экзцинацию максимум на 488 нм и 405 нм, соответственно, с выбросом на 525 нм. Оценка соотношения этих уменьшенных и окислимых форм позволяет удобное расчет баланса редокса внутри клетки. В этой статье метода, увековеченные человека тройной отрицательный раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231) были использованы для оценки состояния redox в живой клетке. Протокол шаги включают MDA-MB-231 клеточной линии трансдукции с аденовирусом, чтобы выразить цитозолик roGFP, лечение H2O2, и оценка цистеина и цистина соотношение как с потоком цитометрии и флуоресценции микроскопии.

Состояние редокса CyS/CySS легко проецируется с помощью трансимированных roGFPs. Флуоресцентный зонд количественно определяет соотношение между уменьшенными и окислимыми формами (длины волн возбуждения 488 нм и 405 нм, соответственно). Данные о флуоресценции могут быть получены как с помощью ц...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Этот протокол описывает оценку субклеточного отсека-специфического редокса статуса в клетке. Красный флуоресцентный зонд, чувствительный к редоксу, позволяет проводить удобный коэффициентометрический анализ в нетронутых клетках.

Оценка клеточного окисления с помощью подклеточного сулярного редокса-чувствительного зеленого флуоресцентного белка

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Текущие протокольные оценщики в текстильном, редоксном состоянии меняются внутриклеточным отсеком. Наш протокол позволяет лучше понять и контролировать все физиологические или патофизиологические механизмы окислительного стресса. Этот метод позволяет не-разрушительной количественной оценки соотношения сульфида глаза в нетронутых клетках, используя соотношение метрических выходных, чтобы уравновесить различия между уровнями выражения сигнала, отбеливание фото, и обнаружение чувствительности.Этот протокол может быть применен к различным организмам, в том числе бактерий в растениях. В первый день эксперимента лечить клетки из стеченной линии раковых клеток молочной железы в течение двух минут, с двумя миллилитров 0,2, 5%поездки в ЭДТА. Когда клетки начинают отделять арест реакции с шестью миллилитров полной среды и осадок клеток центрифугации.Повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров свежей, полной среды, подсчитайте клетки и разбавьте их в 1,5 раза от 10 до пятых клеток на один миллилитр полной среды. Затем семена 1,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр клеток на колодец в 6 хорошо пластины, и инкубировать клетки в инкубаторе культуры клеток на ночь. Или не добавляйте вирусный ряд GFP трансдукции.На следующее утро, добавить 12,5, 25 и 50 микролитров от одного до 100 разбавленных шесть раз 10 до 10-й бляшки формирования единиц на миллилитр добавить не вирусный раствор Эстры GFP, в полной среде. Добавьте это в соответствующие скважины или 6 скважин пластины для трансдукций клеток с 50, 100 и 200 умножений инфекции, соответственно. Когда все образцы Скважины были перенесены с вирусом, вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 16 до 24 часов.На следующий день визуализировать клетки с помощью микроскопии флуоресценции и заменить супернатант со средним, без вируса, чтобы клетки восстановиться в течение еще 24 часов. Для определения оптимальной эффективности трансдукции оцените интенсивность флуоресценции и морфологию клеток по цитометрии потока. Не забудьте провести все процедуры, которые могут вызвать инфекцию от аэрозолей или брызг в биобезопасности уровне два сертифицированных биологической безопасности кабинета.Чтобы оценить состояние редокса клеток, на следующее утро, инкубировать клетки и соответствующие Уэллс 6 хорошо пластины с 10 микромолярной перекиси водорода в течение одного часа, прежде чем отделить клетки с 750 микролитров 0,2 5% капает в ЭДТА на колодец, как попродемонстрировано. Остановить реакцию с двумя миллилитров полной среды на колодец и тянуть supernatants для каждого состояния в отдельных 15 миллилитров конических труб. Осадок клеток центрифугации и мыть гранулы в 500 микролитров PBS на колодец центрифугации в два раза.После второй стирки, фильтровать подвески клетки через 40 микрометр сетки в поток цитометрии совместимых труб на льду, защищенных от света. В программном обеспечении цитометра Потока запустите нулевую множественность образца инфекционного контроля. Затем проанализируйте перекись водорода и необработанные клетки.Это позволит вычислить среднее соотношение флуоресцентной интенсивности между окислеными и уменьшенными формами строки GFP, используя формулу, как указано. Вот стратегия gating для выбора большого количества клеток по цитометрии потока показано. Цитометрия потока также может быть использована для определения кривой реакции дозы для анализа строки GFP и наиболее эффективного многообразия ввода инфекции.Согласно множественности инфекции, кривой реакции дозы в этом репрезентативном анализе, 200 множественность инфекции дала самое высокое выражение GFP дороги, но морфология клетки была назойливой предлагая цитотоксичность. Таким образом, оптимальная эффективность трансдукции была определена как множественность инфекции 100. В этом анализе статуса редокса, окислено и уменьшенный ряд GFP означает флуоресценции интенсивности были получены из потока цитометрии анализа для транспортного средства и четыре 10 микромоляных положительный контроль перекиси водорода лечения.Наложенные гистограммы представляют сдвиги в количестве клеток в 10 микромоляных перекиси водорода и обработанных транспортным средством групп или уменьшенных и окислимых размывают GFP. Расчет соотношения между окисляемой и уменьшенной строкой GFP для этого анализа показал, что 10 микромоляных перекиси водорода вызвали трехкратный рост окисления ряда GFP по сравнению с обработкой транспортного средства. Наличие точных номеров клеток имеет важное значение для расчетов МРТ и воспроизводимости.Для того, чтобы иметь воспроизводимые результаты, исследователи должны тщательно смешивать противовирусные растворы для получения однородных суспензий. Этот протокол позволяет исследователям изучать быстрые изменения редокса как неотъемлемую часть широкого спектра нормальных клеточных процессов и прогрессирования заболевания в режиме реального времени.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток