Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
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El adenovirus constructor y recombinante para expresar roGFP específico de citosol en células se generó en el laboratorio de Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University y ViraQuest Inc., respectivamente. Este estudio fue apoyado por el Centro de Estudios de Respuesta Anfitriona a la Terapia del Cáncer subvención P20GM109005 a través del NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. La instalación del núcleo de citometría de flujo fue apoyada en parte por el Centro de Patogénesis Microbiana y Respuestas Inflamatorias anfitrionas otorgadaS P20GM103625 a través del COBRE NIGMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. ATA fue apoyada por la beca 2214-A del Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK).

NOTA: Este protocolo se optimizó para celdas MDA-MB-231 confluentes del 70% al 80%. Para otras líneas celulares, se debe reoptimizar el número de células y la multiplicidad de infección (MOI).
1. Preparación de células (día 1)
<ol><li>Mantener la línea celular MDA-MB-231 en matraces de 75 cm2 con 10 ml del medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC en una atmósfera humidificada de 5% CO2. NOTA: D...

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

El equilibrio tiol/disulfuro en un organismo refleja el estado redox de las células. Los organismos vivos tienen glutatión, cisteína, tioles proteicos y tioles de bajo peso molecular, todos los cuales se ven afectados por el nivel de oxidación y se hacen eco del estado redox de las células4. Los roGRP diseñados permiten la cuantificación no disruptiva del equilibrio tiol/disulfuro a través de sus residuos CyS7. La propiedad ratiométrica de roGFP proporciona medicio...

El estrés oxidativo fue definido en 1985 por Helmut Sies como "una alteración en el equilibrio prooxidante-antioxidante a favor de la primera"1, y se ha llevado a cabo una plétora de investigación para obtener enfermedad-, nutrición-, y el envejecimiento-específico estado redox de los organismos1,2,3. Desde entonces, la comprensión del estrés oxidativo se ha vuelto más amplia. Probar las hipótesis del uso de antioxidantes contra enfermedades y/o envejecimiento ha demostrado que el estrés oxidativo no sólo causa daño, sino que también tiene otras funciones en las células. Además, los científicos han demostrado que los radicales libres desempeñan un papel importante en la transducción de señales2. Todos estos estudios refuerzan la importancia de determinar los cambios en la relación reducción-oxidación (redox) de las macromoléculas. La actividad enzimática, antioxidantes y/o oxidantes, y los productos de oxidación se pueden evaluar con varios métodos. Entre estos, los métodos que determinan la oxidación del tiol son posiblemente los más utilizados porque informan sobre el equilibrio entre antioxidantes y proxóxidos en las células, así como los organismos4. Específicamente, las relaciones entre el disulfuro de glutatión (GSH)/glutatión (GSSG) y/o cisteína (CyS)/cistina (CySS) se utilizan como biomarcadores para controlar el estado de redox de los organismos2.
Los métodos utilizados para el ensayo del equilibrio entre prooxidantes y antioxidantes dependen principalmente de los niveles de proteínas reducidas/oxidadas o moléculas pequeñas dentro de las células. Las manchas occidentales y la espectrometría de masas se utilizan para evaluar ampliamente las proporciones de macromoléculas reducidas/oxidadas (proteínas, lípidos, etc.), y las proporciones GSH/GSSG se pueden evaluar con espectrofotometría5. Una característica común de estos métodos es la perturbación física del sistema por lelisis celular y/o homogeneización tisular. Estos análisis también se vuelven desafiantes cuando es necesario medir el estado de oxidación de diferentes compartimentos celulares. Todas estas perturbaciones causan artefactos en el entorno de ensayo.
Las proteínas fluorescentes sensibles a redox abrieron una era ventajosa para evaluar el equilibrio redox sin causar una perturbación en las células6. Pueden apuntar a diferentes compartimentos intracelulares, permitiendo la cuantificación de actividades específicas del compartimiento (por ejemplo, el ensayo del estado redox de las mitocondrias y el citosol) para investigar la interferencia entre los orgánulos celulares. Meyer y sus colegas6revisan la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente verde (GFP) y las proteínas HyPeR. Entre estas proteínas, GFP sensible al redox (roGFP) es único debido a las diferentes lecturas fluorescentes de sus residuos CyS (por ejemplo, 488 nm/em. 525 nm) y CySS (por ejemplo, 405 nm/525 nm), que permite el análisis ratiométrico, a diferencia de otras proteínas sensibles al redox como YFP7,,8. La salida ratiométrica es valiosa porque contrarresta las diferencias entre los niveles de expresión, las sensibilidades de detección y el fotoblanqueo8. Los compartimentos subcelulares de las células (citosol, mitocondrias, núcleo) u diferentes organismos (bacterias, así como células de mamíferos) pueden ser objetivo mediante la modificación de roGFP7,9,10.
Los ensayos roGFP se llevan a cabo utilizando técnicas de imagen fluorescente, especialmente para experimentos de visualización en tiempo real. Los análisis citométricos de flujo de roGMP también son posibles para experimentos con puntos de tiempo predeterminados. El artículo actual describe tanto el uso de la microscopía fluorescente como la citometría de flujo para realizar una evaluación ratiométrica del estado de redox en las células de los mamíferos que sobreexpresan el roGFP (dirigido al citosol) a través de la transducción adenoviral.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

La medición del equilibrio de oxidación/reducción intracelular proporciona una visión general del estado redox fisiológico y/o fisiopatológico de un organismo. Los tioles son especialmente importantes para iluminar el estado redox de las células a través de sus proporciones reducidas de ditiool y disulfuro oxidado. Las proteínas fluorescentes que contienen cisteína de diseño abren una nueva era para los biosensores sensibles al redox. Una de ellas, la proteína fluorescente verde sensible al redox (roGFP), se puede introducir fácilmente en las células con transducción adenoviral, lo que permite evaluar el estado redox de los compartimentos subcelulares sin interrumpir los procesos celulares. Las ciisteínas reducidas y las cistinas oxidadas de roGFP tienen máximas de excitación a 488 nm y 405 nm, respectivamente, con emisión a 525 nm. La evaluación de las proporciones de estas formas reducidas y oxidadas permite el cálculo conveniente del equilibrio redox dentro de la célula. En este artículo del método, se utilizaron células de cáncer de mama de triple negativo humano inmortalizados (MDA-MB-231) para evaluar el estado de redox dentro de la célula viva. Los pasos del protocolo incluyen la transducción de línea celular MDA-MB-231 con adenovirus para expresar roGFP citosólico, el tratamiento con H2O2y la evaluación de la relación de cisteína y cistina con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.

El estado redox de CyS/CySS se ensaya fácilmente con roGPPs transducidos. La sonda fluorescente cuantifica la relación entre las formas reducidas y oxidadas (longitudes de onda de excitación 488 nm y 405 nm, respectivamente). Los datos de fluorescencia se pueden obtener mediante citometría de flujo y microscopía.
Un gran número de células se pueden adquirir de manera consistente y conveniente utilizando la citometría de flujo. El análisis consta de 3 pasos principales: 1) seleccionar ...

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Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Los evaluadores de protocolo actuales en textil, redox estado cambios de una manera intracelular compartimiento-específica. Nuestro protocolo permite una mejor comprensión y seguimiento de todos los mecanismos fisiológicos o fisiopatológicos del estrés oxidativo. Esta técnica permite la cuantificación no disruptiva de la relación de sulfuro ocular en mosaico en celdas intactas utilizando una salida métrica de relación para contrarrestar las diferencias entre los niveles de expresión de señal, el blanqueo fotográfico y las sensibilidades de detección.Este protocolo se puede aplicar a varios organismos, incluidas las bacterias de las plantas. En el primer día del experimento tratar las células de una línea de células de cáncer de mama confluente durante dos minutos, con dos mililitros de 0.2, 5% viajes en EDTA. Cuando las células comienzan a desprenderse detienen la reacción con seis mililitros de medio completo y sedimentan las células por centrifugación.Re suspenda el pellet en cinco mililitros de medio fresco y completo, cuente las células y diluya a 1,5 veces 10 a las quintas células por mililitro de medio completo. Luego se siembra 1.5 veces 10 a las quintas células por mililitro de células por pozo en una placa de 6 pozos, e incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante la noche. O no agregue ninguna transducción de GFP de fila viral.A la mañana siguiente, agregue 12,5, 25 y 50 microlitros de uno a 100 diluidos seis veces 10 a las unidades formadoras de placa 10 por mililitro de no añadir ninguna solución viral de Erode GFP, en medio completo. Añadir que a los pozos apropiados o la placa de 6 pozos para transducir las células con 50, 100 y 200 multiplicidades de infección, respectivamente. Cuando todos los pozos de muestra se hayan transducido con virus, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 16 a 24 horas.Al día siguiente, visualice las células por microscopía de fluorescencia y reemplace el sobrenadante por medio, sin virus para permitir que las células se recuperen durante 24 horas adicionales. Para determinar la eficiencia óptima de la transducción, evalúe la intensidad de fluorescencia y la morfología de las células por citometría de flujo. Asegúrese de llevar a cabo todos los procedimientos que pueden causar infección por aerosoles o salpicaduras dentro de un gabinete de seguridad biológica certificado de nivel dos.Para evaluar el estado redox de las células, a la mañana siguiente, incubar las células y los Wells apropiados de la placa de 6 pozos con 10 peróxido de hidrógeno micromolar durante una hora, antes de separar las células con 750 microlitros de 0,2 5% gotea en EDTA por pozo, como se ha demostrado. Detenga la reacción con dos mililitros de medio completo por pozo y tire de los sobrenadantes para cada condición en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Sedimentar las células por centrifugación y lavar los pellets en 500 microlitros de PBS por pozo por centrifugaciones dos veces.Después del segundo lavado, filtre las suspensiones celulares a través de mallas de 40 micrometro en tubos compatibles con citometría de flujo sobre hielo, protegidos de la luz. En el software del citometro flow, ejecute la muestra de control de infección de la multiplicidad cero. Luego analice el peróxido de hidrógeno y las células no tratadas.Permitirá calcular la relación de intensidad fluorescente media entre las formas oxidadas frente a las reducidas de la GFP de fila, utilizando la fórmula como se indica. Aquí está la estrategia de medición para seleccionar un gran número de celdas por citometría de flujo se muestra. La citometría de flujo también se puede utilizar para determinar la curva de respuesta a la dosis para el análisis de GFP de fila y la multiplicidad más eficiente de entrada de infección.Según la multiplicidad de infección, curva de respuesta a la dosis en este análisis representativo, una multiplicidad de 200 de infección dio la mayor expresión de GFP en carretera, pero la morfología celular se realizó sugiriendo citotoxicidad. Por lo tanto, se determinó que la eficiencia óptima de transducción era una multiplicidad de infección de 100. En este análisis de estado redox, se obtuvieron intensidades de fluorescencia medias de GFP oxidadas y reducidas a partir del análisis de citometría de flujo para vehículos y cuatro tratamientos de peróxido de hidrógeno de control positivo micromolar de 10 micromolares.Los histogramas superpuestos representan los cambios en el número de células en los 10 grupos de peróxido de hidrógeno micromolar y grupos tratados con vehículos o GFP de eyúdido reducido y oxidado. El cálculo de la relación entre el GFP de fila oxidado y reducido para este análisis reveló que el peróxido de hidrógeno micromolar 10 causó un aumento triple en la oxidación de la GFP de fila en comparación con el tratamiento del vehículo. Tener números de celda precisos es importante para los cálculos de RMN y la reproducibilidad.Con el fin de tener resultados reproducibles, los investigadores deben mezclar a fondo las soluciones antivirales para obtener suspensiones homogéneas. Este protocolo permite a los investigadores estudiar los cambios rápidos de redox como parte integral de la amplia gama de procesos celulares normales y de la progresión de la enfermedad en tiempo real.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

Bioquímica

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio