Name: assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Konstruktionen och rekombinanta adenovirus för att uttrycka cytosol-specifika roGFP i celler genererades i laboratoriet av Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, och ViraQuest Inc., respektive. Denna studie stöddes av Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 genom NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation / Medicinsk forskning Endowment Award AWD00053956, UAMS årsskiftet kansler's Awards AWD00053484. Flödescytometrikärnan stöds delvis av Center for Microbial Pathogenesis och Host Inflammatory Responses grant P20GM103625 genom COBRE NIGMS. Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH:s officiella åsikter. ATA fick stöd av The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2214-A stipendium.

Det här protokollet har optimerats för 70–80 % samtidiga MDA-MB-231-celler. För andra cellinjer bör antalet celler och infektionsmultipendier (MOI) återuppbyggas.
1. Beredning av celler (dag 1)
<ol><li>Underhåll MDA-MB-231 cellinje i 75 cm2 flaskor med 10 ml Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad atmosfär. OBS: DMEM kompletteras med 10% FBS, 37 °C, och en 5% CO2 f...

<ol>
	<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+Oxidative+Stress.">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li><li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress:+Harms+and+Benefits+for+Human+Health.">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).</li><li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol/disulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing.">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li><li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling.">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Bj&#246;rnberg, O., &#216;stergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors.">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li><li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection.">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion.">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis.">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li><li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer.">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li><li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy.">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li><li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging:+One+step+closer+to+physiology.">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes.">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li></ol>

Den tiol/disulfid balans i en organism återspeglar redox status av celler. Levande organismer har glutation, cystein, protein tioler, och lågmolekylära tioler, som alla påverkas av nivån av oxidation och upprepa redox status cellerna4. Konstruerade roGFPs tillåter icke-störande kvantifiering av tiol/ disulfidbalansen via deras CyS rester7. Den ratiometriska egenskapen hos roGFP ger tillförlitliga redoxmätningar för däggdjursceller. roGFP kan enkelt föras in i ce...

Oxidativ stress definierades 1985 av Helmut Sies som "en störning i prooxidant-antioxidant balans till förmån för den förra"1, och en uppsjö av forskning har utförts för att få sjukdom-, näring-, och åldrande-specifika redox status av organismer1,2,3. Sedan dess har förståelsen av oxidativ stress blivit bredare. Testa hypoteser att använda antioxidanter mot sjukdomar och / eller åldrande har visat att oxidativ stress inte bara orsakar skada utan också har andra roller i celler. Dessutom har forskare visat att fria radikaler spelar en viktig roll för signaltransduktion2. Alla dessa studier stärker vikten av att bestämma förändringarna i minskning-oxidation (redox) förhållandet mellan makromolekyler. Enzymaktivitet, antioxidanter och/eller oxidanter, och oxidationsprodukter kan bedömas med olika metoder. Bland dessa, metoder som bestämmer tiool oxidation är utan tvekan den mest använda eftersom de rapporterar om balansen mellan antioxidanter och prooxidanter i celler, liksom organismer4. I synnerhet används förhållandet mellan glutation (GSH)/glutationdisulfid (GSSG) och/eller cystein (CyS)/cystin (CySS) som biomarkörer för övervakning av organismernas redoxstatus2.
Metoder som används för att analysera balansen mellan prooxidanter och antioxidanter bygger främst på nivåerna av reducerade/oxiderade proteiner eller små molekyler i celler. Västerländska blots och masspektrometri används för att i stort sett bedöma förhållandet mellan reducerade/oxiderade makromolekyler (protein, lipider etc.), och GSH/GSSG-förhållanden kan bedömas med spektrofotometri5. Ett vanligt inslag i dessa metoder är den fysiska störningen av systemet genom celllys och/eller vävnadshomogenisering. Dessa analyser blir också utmanande när det är nödvändigt att mäta oxidationsstatus för olika cellulära fack. Alla dessa störningar orsakar artefakter i analysen miljön.
Redox-känsliga fluorescerande proteiner öppnade en fördelaktig era för att utvärdera redoxbalansen utan att orsaka störningar i cellerna6. De kan rikta olika intracellulära fack, vilket gör det möjligt att kvantifiera fackspecifika aktiviteter (t.ex. analysera redox tillståndet för mitokondrierna och cytosol) för att undersöka överhörning mellan cellulära organeller. Gult fluorescerande protein (YFP), grönt fluorescerande protein (GFP) och HyPeR-proteiner granskas av Meyer och kollegor6. Bland dessa proteiner är redox-känsliga GFP (roGFP) unik på grund av olika fluorescerande avläsningar av cys (ex. 488 nm/em. 525 nm) och CySS (ex. 405 nm/525 nm) rester, vilket möjliggör ratiometrisk analys, till skillnad från andra redox-känsliga proteiner som YFP7,8. Ratiometric output är värdefull eftersom det uppväger skillnaderna mellan uttrycksnivåer, detektionskänsligheter och fotobleaching8. Subcellulära delar av celler (cytosol, mitokondrierna, kärnan) eller olika organismer (bakterier och däggdjursceller) kan riktas genom att ändra roGFP7,,9,10.
roGFP-analyser utförs med fluorescerande bildtekniker, särskilt för visualiseringsexperiment i realtid. Flödescytometriska analyser av roGFPs är också möjliga för experiment med förutbestämda tidpunkter. Den aktuella artikeln beskriver både användningen av fluorescerande mikroskopi och flöde cytometri att utföra en ratiometric bedömning av redox status i däggdjursceller överuttrycka roGFP (riktade till cytosol) via adenoviral transduktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>Cell seeding material for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml tubes with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Single cell suspension tube for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell seeding material for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C15B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4306414</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenoviral cytosol specific roGFP</td>
			<td>ViraQuest</td>
			<td>VQAd roGFP</td>
			<td>roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counter chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 20 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-161</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered pipette tips, sterile, 1000 &#181;l</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-717-166</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td>
			<td>Evos FL</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, Custom</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>CUB0037</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cube, GFP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Human epithelial breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 ml</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco by Life Sciences</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Hood Mate Model 360</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 1 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 5 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologycal pipet, 10 ml</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERACell 150i</td>
			<td>CO2 incubator for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of cellular oxidation using a subcellular compartment-specific redox-sensitive green fluorescent protein

Mätning av den intracellulära oxidations-/reduktionsbalansen ger en översikt över en organisms fysiologiska och/eller patofysiologiska redoxstatus. Thioler är särskilt viktiga för att belysa redox status av celler via deras minskade dithiol och oxiderad disulfid nyckeltal. Konstruerade cysteinhaltiga fluorescerande proteiner öppnar en ny era för redoxkänsliga biosensorer. En av dem, redox-känsliga gröna fluorescerande protein (roGFP), kan enkelt införas i celler med adenoviral transduktion, vilket gör att redox status subcellulära fack som skall utvärderas utan att störa cellulära processer. Minskad cysteiner och oxiderade cystiner av roGFP har excitation maxima på 488 nm och 405 nm, respektive, med utsläpp på 525 nm. Att bedöma förhållandet mellan dessa reducerade och oxiderade former gör det möjligt att bekvämt beräkna redoxbalansen i cellen. I denna metod artikel, förevigade mänskliga trippel-negativa bröstcancerceller (MDA-MB-231) användes för att bedöma redox status inom den levande cellen. Protokollet steg inkluderar MDA-MB-231 cellinje transduktion med adenovirus att uttrycka cytosolic roGFP, behandling med H2O2,och bedömning av cystein och cystin förhållandet med både flöde cytometri och fluorescensmikroskopi.

Redox-tillståndet för CyS/CySS är lätt att analysera med transducerade roGFPs. Den fluorescerande sonden kvantifierar förhållandet mellan de reducerade och oxiderade formerna (excitationsvåglängder 488 nm respektive 405 nm). Fluorescensdata kan erhållas genom både flödescytometri och mikroskopi.
Ett stort antal celler kan konsekvent och bekvämt förvärvas med hjälp av flödescytometri. Analysen består av tre huvudsteg: 1) välj cellpopulation av intresse med FSC-områdesfiltret ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Detta protokoll beskriver bedömningen av subcellulära fack-specifika redox status inom cellen. En redox-känslig fluorescerande sond möjliggör bekväm ratiometrisk analys i intakta celler.

Bedömning av cellulär oxidation med hjälp av ett subcellulärt fackspecifikt Redox-sensitive green fluorescerande protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Aktuella protokoll bedömare i textil, redox tillstånd förändringar i en intracellulär fack-specifika sätt. Vårt protokoll möjliggör en bättre förståelse och övervakning av alla de fysiologiska eller patofysiologiska mekanismerna i oxidativ stress. Denna teknik gör icke-störande kvantifiering av det kaklade ögat sulfid förhållandet i intakt celler med hjälp av ett förhållande metriska utdata att motvikt skillnaderna mellan signaluttryck nivåer, foto blekning och detektion känslighet.Detta protokoll kan tillämpas på olika organismer, inklusive bakterier i växter. På dag ett av experimentet behandla cellerna från en konfluent bröstcancer cellinje i två minuter, med två milliliter på 0,2, 5%resor i EDTA. När cellerna börjar lossa gripa reaktionen med sex milliliter av komplett medium och sediment cellerna genom centrifugeringen.Re avbryta pelleten i fem milliliter färskt, komplett medium, räkna cellerna och späd dem till 1,5 gånger 10 till de femte cellerna per en milliliter av komplett medium. Sedan utsäde 1,5 gånger 10 till den femte celler per milliliter av celler per brunn i en 6 brunnsplatta, och inkubera cellerna i cellodlingen inkubator över natten. Eller lägg till ingen viral rad GFP transduktion.Nästa morgon, tillsätt 12,5, 25 och 50 mikroliter av en en till 100 utspädd sex gånger 10 till den 10: e plack bildar enheter per milliliter av lägga till någon viral urholka GFP lösning, i komplett medium. Lägg till att till lämpliga brunnar eller 6 väl plattan att transduce cellerna med 50, 100 och 200 multiplicering av infektion, respektive. När alla av provet Wells har transduced med virus, returnera cellerna till cellodling inkubatorn för 16 till 24 timmar.Nästa dag, visualisera cellerna genom fluorescens mikroskopi och ersatte supernatanten med medium, utan virus för att tillåta cellerna att återhämta sig i ytterligare 24 timmar. För att bestämma den optimala transduktionseffektiviteten, bedöm cellernas fluorescensintensitet och morfologi genom flödescytometri. Var noga med att genomföra alla de förfaranden som kan orsaka infektion från aerosoler eller stänk inom en biosäkerhet nivå två certifierade biologiska säkerhetsskåp.För att bedöma cellernas redoxstatus, nästa morgon, inkuberar cellerna och lämpliga Brunnar i 6 brunnsplattan med 10 mikromolarvätsperoxid i en timme, innan cellerna lossnar med 750 mikroliter på 0,2 5 %droppar i EDTA per väl, vilket visats. Stoppa reaktionen med två milliliter komplett medium per brunn och dra supernatanterna för varje tillstånd i enskilda koniska 15 milliliterrör. Sediment cellerna genom centrifugation och tvätta pellets i 500 mikroliter PBS per brunn genom centrifugeringar två gånger.Efter den andra tvätten, filtrera cellen suspensioner genom 40 mikro meter maskor i flödescytometri kompatibla rör på is, skyddas från ljus. I flow cytometer programvara, kör noll multiplicity av infektion kontroll prov. Analysera sedan väteperoxiden och obehandlade celler.Det kommer att möjliggöra beräkning av medelvärdet fluorescerande intensitet förhållandet mellan de oxiderade kontra reducerade former av rad GFP, med hjälp av formeln som anges. Här är den gating strategi för att välja ett stort antal celler genom flödescytometri visas. Flödescytometri kan också användas för att bestämma dosresponskurvan för rad-GFP-analys och den mest effektiva multipliciteten av infektionsinsats.Enligt multipliciteten av infektion, dos respons kurvan i denna representativa analys, en 200 multiplicity av infektion gav den högsta vägen GFP uttryck, men cellen morfologi var verkställs tyder cytotoxicitet. Därför var den optimala transduktionseffektiviteten fast besluten att vara en multiplicity av infektion av 100. I denna redox status analys, oxiderade och minskad rad GFP medelvärde fluorescens intensities erhölls från flow cytometry analys för fordon och fyra 10 mikromolar positiv kontroll väteperoxid behandlingar.De överlagrad histogrammen representerar förskjutningarna i cellens nummer i de 10 mikromolar väteperoxid- och fordonsbehandlade grupperna eller reducerade och oxiderade erodera GFP. Beräkning av förhållandet mellan den oxiderade och minskade raden GFP för denna analys visade att 10 mikromolar väteperoxid orsakade en trefaldig ökning av oxidation av rad GFP jämfört med fordonet behandling. Att ha noggranna cellnummer är viktigt för MRI-beräkningar och reproducerbarhet.För att få reproducerbara resultat bör forskarna noggrant blanda de antivirala lösningarna för att få homogena suspensioner. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att studera snabba redox förändringar som en integrerad del av det breda utbudet av normala cellulära processer och av sjukdomsprogression i realtid.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infraröd elektrokemi visat för studie av H2 Oxidation av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur lösning av den fluorescerande Protein Cerulean använder MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extraktion och analys av taiwanesiska grön Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...