Name: isolation of adipose tissue nuclei for single-cell genomic applications
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00
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Ringraziamo David Reynolds, del nucleo di Albert Einstein Genomics, e Jinghang shang dal Flow Cytometry Core per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) (DK110426) e dei Pilot and Feasibility Grants dell'Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e del New York Obesity Research Center (DK026687) (tutti a K.S.). Vorremmo anche ringraziare Albert Einstein Cancer Center (CA013330) per il supporto di base.

La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso presso l'Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparazione di digestione tissutale e buffer di lisi
<ol><li>Preparare il buffer di digestione dei tessuti.<ol>
<li>Preparare 1 mL di tampone di digestione per ogni grammo di tessuto adiposo.</li>
		<li>Pesare 1.5 U/mL collagenae D e 2.4 U/mL dispase II e aggiungere fosfato buffersa salina (PB...

<ol>
	<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans.">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li><li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men.">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li><li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults.">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li><li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans.">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans:+effects+of+cold+exposure+and+adiposity.">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li><li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans.">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+&#946;3-adrenergic+receptor+agonist.">Activation of human brown adipose tissue by a &#946;3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li><li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue.">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CL316,243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes.">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state.">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li><li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types.">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo.">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells.">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049 (2017).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li><li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs.">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion.">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells.">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li><li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells.">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li><li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics.">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).</li></ol>

Viene presentato un metodo semplice e robusto per isolare i singoli nuclei e studiare l'eterogeneità del tessuto adiposo. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di tessuto intero, questo flusso di lavoro offre una visione imparziale dell'eterogeneità cellulare e dei marcatori specifici della popolazione. Questo è significativo e innovativo per il progresso della biologia adipocite, metabolismo molecolare, e la ricerca sull'obesità.
Questo protocollo è particolarmente ottimizzato per l'applic...

Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l'esposizione cronica al freddo, un processo chiamato "marrone" o "sbiancamento". Attraverso l'uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti hanno depositi sostanziali di UCP1- BAT, soprattutto nella regione supraclavicolare1,2,3.4 La quantità di BAT umano adulto è inversamente correlata all'adiposità e può essere aumentata da segnali esterni, come l'esposizione cronica al freddo5,6 o z3-adrenergic recettore agonista7. Il dispendio energetico mediato da BAT può offrire un approccio praticabile per combattere l'obesità.
Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici sono stati considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi hanno rivelato l'esistenza di più sottotipi o sottopopolazioni distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso del substrato e nel trascrittoma8,9,10. Per esempio, un tipo di adipocito beige che utilizza preferibilmente glucosio per la termogenesi, l'adipocito g-beige, è stato recentemente descritto10. La comprensione incompleta dei tipi di cellule nel tessuto adiposo marrone e beige e la mancanza di marcatori specifici costituiscono una barriera critica allo studio delle loro funzioni biologiche.
I metodi tradizionali per isolare le sottopopolazioni di cellule si basano sull'espressione di pochi geni marcatori noti. I recenti progressi nella genomica a singola cellula consentono l'uso di dati di espressione genica globale di singole cellule per fornire una stima imparziale del numero di sottopopolazioni in un tessuto. L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di determinare tutti i sottotipi di tessuto adiposo sotto vari stimoli termogenici ad una risoluzione a cella singola. A differenza di altri tessuti e tipi di cellule, determinare i sottotipi cellulari del tessuto adiposo è difficile a causa della fragilità degli adipociti pieni di lipidi. Questo documento introduce un protocollo robusto per isolare singoli nuclei dal tessuto adiposo per l'applicazione a valle al sequenziamento dello snRNA. È importante sottolineare che la letteratura recente che confronta i set di dati di sequenziamento dell'RNA a nuclei singoli (snRNA-seq) e di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivelato che il snRNA-seq è paragonabile allo scRNA-seq nel rilevamento del tipo di cellula e superiore nella copertura cellulare per un tessuto complesso come il cervello11. Questo protocollo combina un metodo di centrifugazione a gradiente di densità ottimizzato per i tessuti adiposi di Rosen et al.12 con un passo di "pulizia" nuclei con un MoFlo XDP High Speed Sorter. Come si è visto nei risultati rappresentativi, un'analisi di 7.500 nuclei singoli del tessuto adiposo bruno intersbattiare del topo ha identificato più tipi di cellule all'interno di adipociti bruni apparentemente omogenei. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale di adipociti e cellule residenti adiposi, l'identificazione di geni marcatori specifici del sottotipo e la fenotipizzazione dello sviluppo di topi adipose-selettivi/transgenici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>PBS with EDTA; sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell filter 100 &#956;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell filter 40&#956;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrics (30 &#956;m)</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>Stackable filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFloXDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adipose tissue nuclei for single-cell genomic applications

I grassi marroni e beige sono tessuti adipose specializzati che dissipano l'energia per la termogenesi da vie indipendenti e dipendenti da UCP1 (Uncoupling Protein-1). Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici erano considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che ci sono più sottotipi o sottopopolazioni che sono distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso di substrati e nel trascrittoma. Nonostante i progressi nella genomica a singola cellula, la decomposizione imparziale dei tessuti adiposi in sottotipi cellulari è stata difficile a causa della natura fragile degli adipociti pieni di lipidi. Il protocollo presentato è stato sviluppato per aggirare questi ostacoli isolando efficacemente i singoli nuclei dal tessuto adiposo per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA. L'eterogeneità cellulare può quindi essere analizzata mediante sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatiche.

I nuclei di adipociti non ordinati contengono detriti e doppietti che creano rumore e un elevato background nel sequenziamento a valle dell'RNA a cellule singole. La strategia rappresentativa del gate FACS è illustrata nella Figura 1. I nuclei sono stati selezionati per la prima volta in base alla dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC)(A),quindi sono stati selezionati solo i singlet in base alla combinazione di larghez...

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Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

La decomposizione del tessuto adiposo in sottotipi è stata impegnativa perché la natura fragile dell'adipocite. Questo protocollo è stato sviluppato per superare questo problema con un efficace isolamento di singoli nuclei. Questo flusso di lavoro fornisce nuclei singoli altamente purificati con aggregati nucleari e detriti cellulari ridotti al minimo.Questo è vantaggioso per la profilazione del trascritoma a cella singola di migliaia di cellule. Questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale dell'adipocite nelle loro cellule residenti adipose. E in particolare, allo sviluppo fenotipizzazione, knockout adiposo e topi transgenici.La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale in modo che le persone che non hanno molta esperienza nella gestione dell'adipocite possano replicarsi e comprendere l'eterogeneità degli adiposi. Dopo aver raccolto il tessuto adiposo dai topi, asciugarlo con un tovagliolo di carta e posizionare in un piatto pulito. Aggiungere cloruro di calcio al tampone di digestione a una concentrazione finale di 10 mM.Quindi, aggiungere un piccolo volume al tessuto e tritarlo accuratamente. Aggiungere circa la metà della quantità di tampone di digestione preparato al tessuto tritato. E utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il campione in un tubo di centrifuga da 50 ml.Lavare il piatto con il tampone rimanente e aggiungerlo al tubo da 50 ml. Pipettare il campione su e giù più volte. Quindi, incubarlo per 12-15 minuti a 37 gradi Celsius mentre trema a 200-210 giri/min.Dopo l'incubazione, aggiungere lo 0,5%BSA al campione con un rapporto volume 1 a 1 e mescolare bene con la pipettazione. Centrifugare il campione a 300 xg per cinque minuti a temperatura ambiente per far girare verso il basso la frazione stromovascolare lasciando la frazione adipocite in cima. Filtrare la frazione superiore attraverso un filtro cellulare da 400 m in un tubo da 50 ml.Quindi capovolgere il filtro sul tubo e trasferire gli adipociti su un nuovo tubo utilizzando lo 0,5%BSA per lavare in retromarcia il filtro. Portare il volume totale della BSA a 10-15 mL e pipettare il campione su e giù con pipetta sierologica. Quindi, centrifugarlo di nuovo a 300 xg per cinque minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, utilizzare una punta di pipetta ad ampio foro per trasferire con cura lo strato superiore del campione in un filtro cellulare da 100 m sopra un nuovo tubo pre-refrigerato su ghiaccio. Risciacquare il filtro con una quantità sufficiente di tampone di preparazione dei nuclei, quindi scartarlo. Da questo passo avanti, tieni un campione sul ghiaccio e lavora rapidamente.Lasciare il campione sul ghiaccio per un massimo di due minuti invertendo a intermittenza il tubo per mescolare. Quindi, centrifuga a 1000 xg e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di preparazione dei nuclei.Trasferire il campione su un tubo di microcentrifugo pulito, occupandosi di evitare di toccare le pareti del vecchio tubo. Aggiungere 0,6 unità per inibitore della RNasi L e mescolarlo. Quindi, centrifugare il campione per altri 10 minuti.Rimuovere il supernatante e rimescolare un pellet e 1 mL di tampone di lavaggio dei nuclei. Filtrare due volte il campione in un tubo pulito utilizzando filtri impilabili da 30 m. Quindi, lavare i filtri con circa 300 L di tampone di lavaggio dei nuclei.Per confermare il corretto isolamento dei nuclei sani, macchiare una piccola aliquota del campione con trypan e utilizzare un contatore di celle automatizzato per valutare la dimensione media dei morti e la percentuale di cellule morte. Macchiare una piccola aliquota del campione con DAPI ed esaminarla al microscopio con un obiettivo 20X o superiore. I nuclei dovrebbero essere rotondi e avere una membrana nucleare intatta.Le frecce bianche indicano nuclei senza membrana intatta. Dopo aver ripulito i nuclei con FACS, concentrare questo campione centrifugando a 500 xg per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, ricostituirlo in un volume appropriato di tampone di lavaggio dei nuclei.Per ottenere una concentrazione da 50 a 1500 nuclei per L e procedere con nuclei monochirro RNA seq. Per rimuovere detriti cellulari e farsa, i nuclei adipocite vengono ordinati per dimensioni e granularità per escludere aggregati e multipli nucleari. E infine per gli eventi positivi DAPI.Questa strategia di classificazione si traducono in nuclei singoli altamente purificati con aggregati e detriti minimi. Se ispezionati per microscopia, i nuclei ordinati devono essere rotondi e avere una membrana intatta. Una corretta purificazione dei nuclei può anche essere eseguita con qRT-PCR in tempo reale usando primer per il nascente mRNA Ucp1, un gene marcatore per gli adipociti marroni.La piattaforma del cromo determinò un trascrittame di 7500 nuclei dal tessuto adiposo bruno interscapulare murino. Sette diversi tipi di cellule sono stati rivelati con riduzione della dimensionalità t-SNE e clustering k-means. Tutti gli ammassi espressero Fabp4, un gene pan adipocite e un sottoinsieme espressero un alto livello di mRNA Ucp1.Nuclei isolati e poi confermati anche se questo protocollo può essere sottoposto praticamente a qualsiasi piattaforma di espressione genica a livello di singola cellula, incluso il cromo della genomica 10x.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Ricerca

Genetica

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Purificazione di alto peso molecolare genomico da oidio per lungo-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...