Name: improved fecundity and fertility assay for aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (eagal plates)
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00
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Ringraziamo texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program per il finanziamento. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Adelman per l'aiuto nello sviluppo di questo metodo e suggerimenti durante la stesura del manoscritto, così come i membri del laboratorio Kevin Myles. Ringraziamo anche i recensori e gli editori per il loro aiuto nel migliorare questo manoscritto.

1. Preparazione della piastra
<ol><li>Praticare fori in 24 coperchi di piastre di coltura tissutale bene (4−6 fori per pozzo) utilizzando un trapano domestico con un bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2). NOTA: Questi fori impediscono la condensa dell'acqua dall'agarosio per accumularsi sul coperchio, dove le zanzare possono deporre le uova. La dimensione standard della femmina Ae. aegypti ("Liverpool" strain) è di ~ 3,11 mm di apertura alare. Si consiglia di ridurre le dimensioni...

<ol>
	<li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program.">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).</li><li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity.">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li><li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+(Cinnamosma+sp.)+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373 (2019).</li><li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+transgenesis:+what+is+the+fitness+cost.">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li><li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+(Diptera:+Culicidae).">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).</li><li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+serum+and+BSA,+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti.">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938 (2015).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+SkitoSnack,+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement,+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota.">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).</li><li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP/ZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).</li><li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviplate:+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti.">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103 (2018).</li><li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mosquitoes,+large+implications:+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti.">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 252 (2015).</li><li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+vector+arthropod+culture:+an+example+using+the+African+malaria+mosquito,+Anopheles+gambiae+(Diptera:+Culicidae).">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li></ol>

La piastra EAgaL riduce drasticamente il lavoro, il tempo e lo spazio per condurre test individuali di fecondità e fertilità in Aedes aegypti rispetto al metodo FT. Il confronto preliminare tra il metodo FT e la piastra EAgaL ha comportato tempi più brevi per tutte le fasi (la tecnica di imaging è stata applicata al metodo FT)(tabella 1). Come riferimento, nella tabella 2 sono fornite una stima dei costi di avviamento e di dosaggio (una piastra EAgaL da 24 pozzi contro 24 TT...

Il controllo delle zanzare per proteggere gli esseri umani da agenti patogeni trasmesse da vettori è un importante obiettivo di salute pubblica, principalmente a causa della mancanza di vaccini efficaci per la maggior parte degli agenti patogeni trasportati dalle zanzare. Molti studi mirano a ridurre la forma fisica delle zanzare in combinazione con una strategia di riduzione della popolazioneapplicabile sul campo 1,2,3. Ciò include studi approfonditi per creare zanzare transgeniche e / o linee knockout CRISPR / Cas9. Tali approcci di modifica della popolazione richiedono una valutazione dettagliata dei singoli parametri di idoneità4. Le tecniche di laboratorio convenzionali per valutare l'idoneità delle zanzare femminili includono il contenimento individuale di zanzare femminili accoppiate e alimentate a sangue in contenitori da 100 ml5,tubi conici modificati da 50 ml o tubi per l'allevamento di Drosophila modificati fornendo superfici umide utilizzando cotone umido e dischi di carta filtrante per l'ovideposizione (cioè carte d'uovo)1,2,6,7. Tali metodi richiedono uno spazio relativamente grande (ad esempio, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H per un massimo di 100 tubi Drosophila) (Figura 1),e la manipolazione di singole carte uovo per il conteggio di uova e larve da cova, che possono essere laboriose. Questo manoscritto presenta un metodo per contare le uova di zanzara e determinare i tassi di schiusa utilizzando 24 piastre di pozzo e agarosio come superficie di ovideposizione peraggirare questi problemi 8.
Contemporaneamente, Ioshino etal. Il loro protocollo rappresentava un miglioramento significativo rispetto ai metodi convenzionali nel risparmiare tempo espazio 9. Tuttavia, il protocollo che hanno descritto continua a utilizzare carta filtrante bagnata come superficie per l'ovideposizione, che richiede lo spiegamento di ogni singola carta per ottenere conteggi, poiché le uova si trovano spesso sotto o in pieghe. Il loro protocollo inoltre non includeva l'uso di tecnologie di imaging o un metodo per il conteggio larvale.
Presentato è un metodo migliorato per eseguire test di fitness per il numero di uova (cioè fecondità) e il tasso di schiusa (cioè la fertilità) usando l'agarosio come superficie di ovideposizione in un formato di piastra di coltura tissutale di 24 po 'per Ae. aegypti che oviposit su superfici umidi. Queste tavole sono state chiamate piatti "EAgaL", da Egg, Agarose e Larva. Questi 24 piastre di pozzo forniscono alle singole zanzare una superficie minima per deporre le uova, semplificando e riducendo drasticamente il tempo e lo sforzo necessari per contare e mantenere le uova e le larve tratteggiate per alcuni giorni. La piastra EAgaL utilizza agarosio traslucido per la superficie di ovideposizione, che elimina la necessità di maneggiare le carte uovo e trovare le uova e le larve quando schiuse; fotografare ogni pozzo stabilisce una registrazione archiviata a lungo termine dei risultati e separa il processo di conteggio sia nel tempo che nello spazio dal processo di allevamento / movimentazione, dove il tempo è spesso limitato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm &#934; drill bit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternatively heated nails can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette tips (long)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>930186</td>
			<td>clear, flat-bottom with ringed lid plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TG-5/TG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer (Windows, Mac or Linux)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (imageJ) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>download from: https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>sharp forceps may break mosquito&#39;s body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Household bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Household electric drill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illuminator for stereomicroscope (gooseneck)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software (Microsoft Excel)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Any spreadsheet software works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraMin fish food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td></td>
			<td>ground with coffee grinder, blender or morter &#38; pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipetts</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16011-188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved fecundity and fertility assay for aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (eagal plates)

Le zanzare rappresentano un problema significativo di salute pubblica come vettori di vari agenti patogeni. Per quegli studi che richiedono una valutazione dei parametri di fitness delle zanzare, in particolare la produzione di uova e i tassi di schiusa a livello individuale, i metodi convenzionali hanno gravato in modo sostanziale sugli investigatori a causa dell'elevata intensità di lavoro e dei requisiti di spazio di laboratorio. Descritto è un metodo semplice che utilizza 24 piastre di coltura tissutale del pozzo con agarosio in ogni pozzo e imaging digitale di ogni pozzo per determinare il numero di uova e i tassi di schiusa a livello individuale con requisiti di tempo e spazio sostanzialmente ridotti.

Le zanzare sono state iniettate con dsRNA che prende di mira un trasportatore di ferro candidato (FeT) o un gene di controllo (EGFP), alimentato dal sangue e misurato per la fecondità e la produzione di fertilità utilizzando il metodo della piastra EAgaL, seguendo la procedura sopra descritta.
Le zanzare in cui l'espressione fet è stata silenziata a seguito dell'iniezione di dsRNA hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa (<strong class="xfig...

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Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Questa procedura consente ai ricercatori di zanzare di affrontare facilmente la forma fisica riproduttiva delle loro zanzare a livello individuale. Rispetto ai metodi convenzionali, questo protocollo riduce significativamente il tempo, lo spazio e il lavoro necessari per testare la fecondità e la fertilità delle zanzare a livello individuale. Inizia preparando le lastre per l'esperimento di ovideposizione.Praticare da quattro a sei fori per pozzo nel coperchio di una piastra di coltura da 24 pozzetto utilizzando un trapano domestico con un bit di 1,6 millimetri. Un giorno prima dell'esperimento, lavare e risciacquare i piatti e immergerli in candeggina dall'1% al 5% per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare accuratamente le piastre sotto l'acqua deionizzata corrente e asciugarle.Sciogliere il 2% di agarosio in acqua deionizzata e aggiungere immediatamente 500 microlitri dell'agarosio fuso a ciascun pozzo di una piastra di 24 pozzi. Lasciare le piastre sulla panchina del laboratorio durante la notte per asciugare qualsiasi condensa. Almeno 16 ore prima dell'alimentazione del sangue, rimuovere qualsiasi fonte di acqua o zucchero dalle zanzare femminili.Il giorno dell'alimentazione, riscaldare un circolatore d'acqua a 37 gradi Celsius e nutrire le zanzare con sangue vertebrato posto in alimentatori artificiali per 15-30 minuti. Quindi, trasferisci le zanzare in un piatto di vetro sul ghiaccio. Selezionare quelli ingoiati dal sangue e metterli in un contenitore con acqua di saccarosio al 30%.Lasciare almeno 72 ore alle femmine per finire escrezione e sviluppo delle uova. Circa un'ora prima di trasferire le zanzare nella piastra da 24 pozze, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere da due a tre gocce d'acqua in ogni pozzo. Abbatti le zanzare con anidride carbonica e trasferiscile in un piatto di vetro sul ghiaccio.Quindi, posizionare individualmente ogni zanzara su un coperchio rovesciato del piatto da 24 pozzi. Una volta posizionate tutte le 24 zanzare, coprire il coperchio con un fondo piatto rovesciato, fissarlo con un nuovo elastico fresco e posizionare in una camera ambientale fino a quando le zanzare non si riprendono. Quindi, ruotare il lato destro della piastra verso l'alto.Lasciare che le zanzare femminili ovoposit per 24-48 ore. Quindi, rimuovere le femmine rilasciandole dai piatti in una grande gabbia. Prima di contare le uova, controllare ognuna bene le uova che si trovano sulle pareti del pozzo e a margine dell'agarosio e della superficie di plastica dove sono difficili da risolvere nelle fotografie.Utilizzare un pennello bagnato per spostare queste uova sulla superficie piana in modo che tutte le uova si trovano su un piano uniforme e non si sovrappongano. Utilizzare le forcep per rimuovere eventuali gambe rotte, ali e altre particelle nei pozzi che possono interferire con l'imaging delle uova. Imposta una fotocamera digitale compatta in modalità microscopio, che consente all'utente di concentrarsi su oggetti vicini a un centimetro e scattare un'immagine di ogni pozzo.Dopo aver fotografato ogni pozzo di un piatto, scatta un'immagine dell'intero piatto. Utilizzare un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in un secondo momento. Aggiungere circa cinque gocce d'acqua a ciascun pozzo per evitare che il suo tappo di agarosio e le uova si asciughino e per indurre lo sviluppo e la schiusa dell'embrione.Trasferire le immagini in un computer e rinominare i file con la piastra e gli ID pozzo per un'organizzazione più semplice. Aprite le immagini con ImageJ e usate lo strumento Multi-point per contrassegnare ogni uovo, ingrandindo o rimpipigliando per contare i grumi di uova. Dopo aver segnato tutte le uova, fare doppio clic sull'icona Multi-point per riportare il numero di indicatori e registrare i risultati in un foglio di calcolo.Inizia ad aggiungere cibo ai pozzi che contengono larve tratteggiate non appena appaiono. Circa cinque o otto giorni dopo, anestetizza le larve coprendo il piatto con ghiaccio schiacciato per 15-20 minuti. Inserire un materiale nero sotto la piastra per migliorare il contrasto e scattare immagini di ogni pozzo mantenendo le piastre sul ghiaccio.Dopo aver fotografato ogni pozzo, scatta un'immagine dell'intera lastra con un'etichetta dell'ordine di imaging. Aprite le immagini con ImageJ e utilizzate lo strumento Multi-point per contare le larve. Le larve possono variare per forma, angolo e messa a fuoco.Escludi le cuticole del capannone, che sembrano larve solo per la testa con un po 'di corpo o larve rimpicciolite. Registrare i risultati nel foglio di calcolo. Alle zanzare è stato iniettato RNA a doppio filamento che prende di mira un trasportatore di ferro candidato, FeT, o un gene di controllo, EGFP.Quindi, sono stati nutriti con sangue e misurati per la fecondità e la produzione di fertilità usando il metodo della piastra eagle. Le zanzare in cui l'espressione del trasportatore di ferro è stata silenziata hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa. Le zanzare silenziate dal FeT mostravano anche escrezioni ritardate e uova piccole e di colore chiaro.Scattare buone foto è un passo fondamentale per questo metodo perché la qualità delle immagini e la quantità di singole uova o larve influenzano direttamente la qualità dei risultati.

Research

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Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

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