Name: improved fecundity and fertility assay for aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (eagal plates)
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00
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私たちは、テキサスA&Mアグリライフ研究昆虫ベクター病助成プログラムに資金を提供してくれたことに感謝します。また、この方法の開発に役立ち、原稿を作成する際の提案に関するAdelmanラボのメンバー、およびケビン・マイルズのラボメンバーに感謝します。また、この原稿をより良くするために、レビュアーや編集者の助けに感謝します。

1. プレートの準備
<ol><li>〜1.6 mm (1/16 in) ビットの家庭用ドリルを使用して、24ウェル組織培養プレートリッド(ウェルあたり4-6穴)に穴を開けます(図2)。 注:これらの穴は、蚊が卵を産む可能性のある蓋に蓄積するアガロースからの水凝縮を防ぎます。女性 Ae.aegypti(「 リバプール」株)の標準サイズは〜3.11ミリメートルの翼幅です。プレートからの脱出を避けるた...

<ol>
	<li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program.">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).</li><li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity.">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li><li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+(Cinnamosma+sp.)+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373 (2019).</li><li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+transgenesis:+what+is+the+fitness+cost.">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li><li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+(Diptera:+Culicidae).">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).</li><li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+serum+and+BSA,+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti.">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938 (2015).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+SkitoSnack,+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement,+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota.">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).</li><li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP/ZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).</li><li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviplate:+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti.">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103 (2018).</li><li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mosquitoes,+large+implications:+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti.">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 252 (2015).</li><li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+vector+arthropod+culture:+an+example+using+the+African+malaria+mosquito,+Anopheles+gambiae+(Diptera:+Culicidae).">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li></ol>

EAgaLプレートは、FT法と比較して Aedes aegypti で個々の胎児性および生殖能力アッセイを行う労力、時間、および空間を大幅に削減します。FT法とEAgaLプレートとの間の予備比較は、すべてのステップに対して短い時間をもたらした(撮像技術はFT法に適用された)(表1)。参考として、起動およびアッセイ当たりの推定値(1つの24ウェルEAgaLプレート対24 FT)コストを 表2<...

ベクター媒介病原体からヒトを保護するための蚊の防除は、主に蚊によって運ばれるほとんどの病原体に対する効果的なワクチンの欠如のために、重要な公衆衛生目標である。多くの研究は、フィールドに適用可能な人口減少戦略1、2、3と組み合わせて蚊のフィットネスを減らすことを目指しています。これには、トランスジェニック蚊および/またはCRISPR / Cas9ノックアウトラインを作成するための広範な研究が含まれます。このような人口改変アプローチは、個々のフィットネスパラメータ4の詳細な評価を必要とする。雌の蚊の適性を評価するための従来の実験室技術は、100 mL容器内の交配された血液を与えられた雌の蚊の個々の封じ込めを含む5、50mL円錐管を改変、または浸出のための湿った綿およびフィルターペーパーディスクを使用して湿った表面を提供することによって変性されるショウジョウバエ飼育のためのチューブ(すなわち、卵紙)1、2、6、7。このような方法は、比較的大きな空間(例えば、30cm x 30cm x 10cm:最大100ショウジョウバエチューブのW x Lx H)と、卵を数え、幼虫を孵化させる個々の卵紙の操作を必要とし、労働集約的であり得る。この原稿は、蚊の卵を数え、これらの問題を回避するために卵位表面として24のウェルプレートとアガロースを使用してハッチ率を決定する方法を提示します 8.
同時に、イオシノら9 は、個々の雌から得られた卵の計数を行うために12および24のウェルプレートを用いた詳細な方法を説明した。彼らのプロトコルは、時間と空間9を節約する従来の方法から大幅な改善を表した。しかし、彼らが説明したプロトコルは、卵がしばしば下または折り畳みで見つかるので、カウントを得るために個々の紙を展開する必要がある排卵の表面としてウェットフィルターペーパーを使用し続けています。彼らのプロトコルには、イメージング技術の使用や幼虫計数の方法も含まれなかった。
提示された、卵の数(すなわち、胎児性)および孵化率(すなわち、生殖能力)をAe.aegyptiの24ウェル組織培養プレートフォーマットでオビジポジション表面として使用する、適合性アッセイを行う改良された方法である。これらのプレートは、Egg、アガローズ、およびLアルバから「EAgaL」プレートと名付けられました。 これらの24のウェルプレートは、卵を産むために最小限の表面を個々の蚊に提供し、卵と孵化した幼虫を数日間数え、維持するために必要な時間と労力を簡素化し、大幅に削減します。EAgaLプレートは、卵の紙を扱い、孵化したときに卵と幼虫を見つける必要がなくなる卵の表面に半透明のアガロースを使用しています。各井戸を撮影すると、結果の長期アーカイブ記録が確立され、時間と空間の両方でカウントプロセスが、時間が限られているリアリング/ハンドリングプロセスから分離されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm &#934; drill bit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternatively heated nails can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette tips (long)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>930186</td>
			<td>clear, flat-bottom with ringed lid plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TG-5/TG-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer (Windows, Mac or Linux)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (imageJ) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>download from: https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>sharp forceps may break mosquito&#39;s body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Household bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Household electric drill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illuminator for stereomicroscope (gooseneck)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software (Microsoft Excel)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Any spreadsheet software works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraMin fish food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td></td>
			<td>ground with coffee grinder, blender or morter &#38; pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipetts</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16011-188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved fecundity and fertility assay for aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (eagal plates)

蚊は、様々な病原体のベクターとして重大な公衆衛生上の問題を表しています。蚊のフィットネスパラメータ、特に個々のレベルでの卵の生産と孵化率の評価を必要とするこれらの研究のために、従来の方法は、高い労働強度と実験室スペース要件のために調査官に大きな負担をかけている。説明は、各ウェルにアガロースを有する24ウェル組織培養プレート及び各ウェルのデジタルイメージングを用いた簡単な方法であり、時間と空間の要件を大幅に削減した個々のレベルで卵数およびハッチ率を決定する。

蚊は、候補鉄輸送体(FeT)または対照遺伝子(EGFP)を標的とするdsRNAを注射し、血液を供給し、EAgaLプレート法を用いて胎児性および生殖能力出力について測定し、上記の手順に従った。
dsRNA注射後にFeT発現が沈黙した蚊は、卵数と孵化率の両方に有意な減少を示した(図11A−C)。すべての制御および治療蚊は、72時間PBM後にEAgaLプレートに入れ...

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Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

記載されているのは、卵を数え、24個の井戸組織培養プレートを使用して個々の蚊の孵化率を決定する時間と省スペースの方法であり、これは胎児性および生殖能力アッセイの規模と速度を大幅に増加させることができる。

24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

この手順は、蚊の研究者が簡単に個々のレベルで蚊の生殖フィットネスに対処することができます。従来の方法と比較して、このプロトコルは、蚊の胎児性と生殖能力を個々のレベルでテストするために必要な時間、スペース、労力を大幅に削減します。まず、卵子実験用のプレートを準備します。1.6ミリメートルの家庭用ドリルを使用して、24ウェル培養プレートの蓋に井戸あたり4〜6穴をドリルします。実験の1日前に、プレートを洗って洗い流し、室温で30〜60分間1%〜5%漂白剤に浸します。その後、脱イオン水を流してプレートを十分に洗い流し、乾燥させます。脱イオン水で2%アガロースを溶かし、すぐに24ウェルプレートの各ウェルに溶融アガロースの500マイクロリットルを追加します。凝縮を乾かすために、一晩ラボベンチにプレートを置いたままにしておきます。血液を摂食する少なくとも16時間前に、雌の蚊から水または砂糖の任意の供給源を取り除く。給餌の日には、サーキュレータを摂氏37度に加熱し、人工フィーダーに入れた脊椎動物の血液で蚊に15〜30分間餌を与えます。その後、蚊を氷の上のガラス皿に移します。血液を含むものを選択し、30%スクロース水で容器に入れます。女性が排泄と卵の発達を終えるのに少なくとも72時間かかります。蚊を24ウェルプレートに移す約1時間前に、移管ピペットを使用して各井戸に2〜3滴の水を加えます。二酸化炭素で蚊を倒し、氷の上のガラス皿に移します。その後、各蚊を24ウェルプレートの逆蓋に個別に置きます。24個の蚊がすべて入れられたら、蓋を反転プレート底で覆い、新鮮な新しいゴムバンドで固定し、蚊が回復するまで環境室に置きます。その後、プレートを右に上に回します。メスの蚊に24~48時間のオビポジットを許可します。次に、メスをプレートから大きなケージに取り出して取り除きます。卵を数える前に、井戸の壁やアガロースとプラスチック表面の余白にある卵を十分にチェックしてください。すべての卵が均一な平面にあり、互いに重ならないように、濡れた絵筆を使用して平らな表面にこれらの卵を移動させます。鉗子を使用して、卵のイメージングを妨げる可能性のある井戸の壊れた脚、翼、および他の粒子を除去します。顕微鏡モードでコンパクトなデジタルカメラを設定すると、1センチメートル近くの物体に焦点を当て、各井戸の画像を撮ることができます。プレートの各ウェルを撮影した後、プレート全体の画像を撮ります。後で各プレートを区別するために、イメージング順序ラベルを使用します。アガロースプラグと卵が乾燥するのを防ぎ、胚の発達と孵化を誘発するために、各井戸に約5滴の水を加えます。コンピュータに画像を転送し、簡単に編成するためにプレートと井戸IDでファイルの名前を変更します。ImageJ で画像を開き、マルチポイント ツールを使用して各卵をマークし、ズームインまたはズームアウトして卵の束を数えます。すべての卵をマークした後、マルチポイントアイコンをダブルクリックしてマークの数を表示し、結果をスプレッドシートに記録します。孵化した幼虫が入った井戸に食べ物を加え始めます。約5~8日後、砕いた氷でプレートを15~20分間覆い、幼虫を麻酔します。プレートの下に黒い材料を挿入してコントラストを高め、プレートを氷の上に置いたまま、各ウェルの画像を撮影します。各ウェルを撮影した後、画像化順ラベルでプレート全体の画像を撮ります。ImageJ で画像を開き、マルチポイント ツールを使用して幼虫を数えます。幼虫は、形状、角度、焦点が異なる場合があります。少しの体を持つ頭のみの幼虫のように見える小屋のキューティークル、または縮んだ幼虫を除外します。結果をスプレッドシートに記録します。蚊は、候補鉄輸送体、FeT、または対照遺伝子であるEGFPを標的とする二本鎖RNAを注射した。その後、彼らは血液供給され、イーグルプレート法を使用して胎児性および生殖能力出力のために測定された。鉄輸送体の発現が沈黙した蚊は、卵数と孵化率の両方で有意な減少を示した。FeTで沈黙した蚊はまた、遅延排泄と小さくて明るい色の卵を示しました。個々の卵や幼虫の写真や量の質が結果の質に直接影響を与えるので、良い写真を撮ることは、この方法のための重要なステップです。

Research

JoVE Journal

Biology

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

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計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定<em&gt;ネッタイシマカ</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

ネッタイシマカ蚊ボルバキアに感染維持

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

照射され、マークされたオスの ネッタイシマカ を、操作可能な滅菌昆虫技術プログラムで放出するための準備

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...