Name: quantification of humic and fulvic acids in humate ores, doc, humified materials and humic substance-containing commercial products
Uploaded: 2022-03-18T13:00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products at JoVE.com

De auteurs willen graag de Humic Products Trade Association (HPTA) bedanken voor hun steun bij het financieren van het werk dat resulteerde in de standaardisatie van de methoden die in dit artikel worden beschreven en ook Lawrence Mayhew en Drs. Dan Olk en Paul Bloom voor technische ondersteuning tijdens het standaardisatiewerk.

1. Voorbereiding van vaste monsters
<ol><li>Plet ongeveer 5 g van het te analyseren monster, met behulp van een vijzel en stamper, zodat 100% van het gemalen monster door een Amerikaanse standaardzeefmaaswijdte nr. 200 (d.w.z. 74 μm) gaat en ervoor zorgt dat het poeder goed gemengd is.</li>
	<li>Bepaal gravimetrisch het vochtgehalte van het poeder.<ol>
<li>Weeg een aluminium weegboot en noteer de massa (Wwb).</li>
		<li>Breng ongeveer 2 g monsterpoeder over in de weegboot en noteer de massa (Wws+wb).</li>
		<li>Plaats de weegboot gedurende 24 uur in een droogoven bij 102 °C (niet meer dan 102 °C). Haal na 24 uur de weegboot uit de droogoven en plaats deze in een exsiccator om minstens 1 uur af te koelen.</li>
		<li>Weeg en noteer de massa van de weegboot en het gedroogde monsterpoeder (Wds+wb).</li>
		<li>Bepaal het vochtgehalte met formule 1.1. Formule 1.1 Vochtgehalte van poeder met vaste monsters % vocht = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extractieprocedure
<ol><li>Vaste monsters<ol>
<li>Weeg ongeveer 2,5 g van het gezeefde monsterpoeder (Wsamp) in een plastic of aluminium weegboot en noteer het gewicht tot op vier decimalen.</li>
		<li>Laad het monster in een maatcilinder van 1 L en vul de cilinder tot 1 L met 0,1 M NaOH (4 g NaOH x L-1).</li>
		<li>Voeg een magneetroerstaaf (bijv. 5 - 7 cm lang) toe en roer snel (d.w.z. 300 - 400 rpm) op een roerplaat totdat het monster grondig is gemengd.</li>
		<li>Breng de volledige inhoud van de maatcilinder over in een Erlenmeyer van 1 L, maak de kopruimte van de kolf vrij met N2-gas en dek de opening van de kolf af met een luchtdicht deksel.</li>
		<li>Leg de Erlenmeyer op een roerplaat en meng bij 300 - 400 rpm gedurende 16 - 18 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vloeibare monsters<ol>
<li>Meng het monster bij vloeibare materialen grondig door te schudden om ervoor te zorgen dat de testvloeistof homogeen wordt gemengd. Zorg ervoor dat eventuele resten die op de bodem van de container zijn gevallen, grondig worden gemengd.</li>
		<li>Voeg ongeveer 5 g van de testvloeistof, gewogen tot op 4 decimalen (WTL), toe aan een maatcilinder van 1 L.</li>
		<li>Vul de gegradueerde cilinder met 0,1 M NaOH tot een eindvolume van 1 L.</li>
		<li>Voeg een magneetroerstaaf (bijv. 5 – 7 cm lang) toe en roer snel (bijv. 300 - 400 rpm) op een roerplaat totdat het testmonster volledig gemengd is.</li>
		<li>Breng het mengsel over in een Erlenmeyer van 1 L, maak de kopruimte vrij met N2-gas en dek de opening van de kolf af met een luchtdicht deksel.</li>
		<li>Leg de Erlenmeyer op een roerplaat en meng gedurende 1 uur bij 300 - 400 rpm. OPMERKING: Na dit punt is de behandeling van vaste en vloeibare monsters hetzelfde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Verwijdering van niet-oplosbare materialen uit alkalische extracten
<ol><li>Verwijder na het roeren de kolf van de roerplaat, breng het mengsel over in geschikte centrifugebuizen en centrifugeer het volledige volume bij 4.921 x g gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Verzamel het alkalische supernatant met de HA en FA in een schone Erlenmeyer van 1 L met een magneetroerstaaf. Gooi het onoplosbare materiaal weg. Filtratie door glaswol of kwalitatief filterpapier met een poriegrootte van 2,5 μm wordt aanbevolen als restdeeltjes na centrifugeren niet worden neergeslagen.</li>
</ol>4. Neerslag en scheiding van HA van FF
<ol><li>Terwijl u het alkalische extract met 300 - 400 rpm op een roerplaat roert, plaatst u een pH-sonde in het middelste gedeelte van de oplossing (verticaal) en voegt u conc. HCl druppelsgewijs toe aan het alkalische extract totdat een stabiele pH van pH 1,0 ± 0,1 is bereikt.</li>
	<li>Zodra een pH van pH 1 is bereikt en stabiel blijft, verwijdert u de pH-sonde uit de kolf, haalt u de roerstaaf op, dekt u de kolf af met een luchtdicht deksel en laat u de kolf zitten totdat de neergeslagen HA op de bodem van de kolf is beland. OPMERKING: De tijd die een HA nodig heeft om neer te slaan en de oplossing te laten vallen, zal variëren afhankelijk van de bron en de hoeveelheid HA in het monster. Het duurt meestal 1 -6 uur voordat de HA volledig neerslaat en uit de oplossing valt.</li>
	<li>Centrifugeer het extract en neergeslagen HA bij 4921 x g gedurende 1 uur. Giet na het centrifugeren de supernatant FF af in een schone 1 L Erlenmeyer en dek af met een luchtdichte hoes. OPMERKING: Een langere centrifugetijd kan nodig zijn om de HA stevig genoeg in te pakken om de FF te kunnen decanteren zonder toevoeging van een van de neergeslagen HA.</li>
	<li>Plaats de centrifugebuizen in een droogoven die gedurende 24 uur op 100 °C wordt gehouden.</li>
	<li>Haal na het drogen de buizen uit de droogoven en plaats ze in een exsiccator om af te koelen tot kamertemperatuur. Breng na afkoeling het residu kwantitatief over van de buis door het met een spatel van de zijkanten en bodem van de buis te schrapen, over te brengen naar een geteerde weegboot en de massa (WEHA) te registreren. Dit residu is de "Geëxtraheerde HA". OPMERKING: Als centrifugebuizen van meer dan 50 ml zijn gebruikt bij de scheiding van HA en FF, is het handig om de neergeslagen HA over te brengen naar temperatuurbestendige centrifugebuizen van 50 ml voor het droogproces. Ook als er een vriesdroger beschikbaar is, kan de neergeslagen HA worden gevriesdroogd. Het verzamelen van de HA in een gevriesdroogde staat is gemakkelijker omdat de HA niet aan de zijkant van de plastic buizen blijft plakken en niet gesloopt hoeft te worden.</li>
</ol>5. Bepaling van het asgehalte
OPMERKING: De procedure voor de bepaling van het asgehalte van gedroogde HA- en FA-monsters is dezelfde. De procedure met notatie voor HA wordt weergegeven.
<ol><li>Breng ongeveer 30 mg van de gedroogde HA (WHA) over in een schone, vooraf gewogen keramische schaal (WCD) die eerder in een droogoven bij 100 °C was gedroogd en vervolgens in een exsiccator tot kamertemperatuur was afgekoeld. Na registratie van de gecombineerde massa van de gewogen HA en schotel (WHA+CD), verbrandt u de HA in een dempingsoven gedurende 2 uur bij 600°C. OPMERKING: Voor elk HA-monster moeten drie duplo's worden verwerkt en moet het gemiddelde asgehalte worden gebruikt bij de berekening van zuivere HA.</li>
	<li>Haal na 2 uur de schaal en de inhoud uit de moffeloven en plaats in een exsiccator om af te koelen. Weeg na het afkoelen de schaal met as (WASH+CD) en bereken de asverhouding (Ashrat) met formule 1.2: Formule 1.2 Ashrat = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)</li>
</ol>6. Bepaling van het percentage gezuiverd geëxtraheerd HA
<ol><li>Bepaal de uiteindelijke massa van de zuivere HA (WPHA) door te corrigeren voor asgehalte met formule 1.3: Formule 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)</li>
</ol>7. Bepaling van de concentratie (%) van zuiver HA in het oorspronkelijke bronmonster
<ol><li>Bepaal de concentratie van zuivere HA met behulp van Formule 1.4 en 1.5: Formule 1.4: % zuivere HA in vaste stof = (WPHA/Wsamp) * 100 Formule 1,5: % zuivere HA in vloeibaar monster = (WPHA/WTL) * 100</li>
</ol>8. Kolomvoorbereiding voor HFA-zuivering
<ol><li>Bereid een lagedrukchromatografiekolom voor die vol zit met polymethylmethacrylaat DAX-8-hars. Als de hars nog niet eerder is gebruikt, weekt u de hars gedurende 2 uur in methanol en spoelt u vervolgens grondig met gedeïoniseerd H2O totdat alle methanol is verwijderd.<ol>
<li>Verwijder kleine harsdeeltjes die op dit moment op het water drijven. Als de hars eerder is gebruikt, regenereer deze dan zoals beschreven in rubriek 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na grondig gespoeld, giet u de hars in een glazen chromatografiekolom van 5 x 25 cm, voorzien van een eindstuk met een frit van 10 μm voor harsbedondersteuning. Laat 2,5 tot 5 cm boven aan de kolom voor een harsvrije oplossing om het mengen van de FF mogelijk te maken voordat u het harsbed binnengaat. Plaats het bovenste stuk op de kolom en pomp gedeïoniseerde H2O door de bovenkant van de kolom om het DAX-8 harsbed te verpakken met behulp van een peristaltische pomp.</li>
</ol>9. Isolatie van HFA
<ol><li>Zodra het harsbed is verpakt, laadt u de FF op de kolom met behulp van een peristaltische pomp, onder lage druk, via de bovenkant van de kolom. Gebruik een debiet van 35 – 40 ml/min. Het is van cruciaal belang dat de bovenkant van de hars in de kolom gedurende de gehele laad- en spoelprocedure bedekt blijft met oplossing om te voorkomen dat de hars uitdroogt en het extract door het harsbed wordt geleid.</li>
	<li>Zodra de fulvinefractie volledig op de hars is geladen, wast u de hars met gedeïoniseerd water om de niet-geadsorbeerde "hydrofiele fulvinefractie" (HyFF) te verwijderen door deze door de bovenkant van de kolom te pompen met behulp van de peristaltische pomp onder lage druk. Gebruik een debiet van 35 – 40 ml/min. Gooi het HyFF-bevattende effluent weg, tenzij het voor analyse wordt gebruikt.</li>
	<li>Was de kolom met gedeïoniseerd H2O totdat de absorptie bij 350 nm van het kolomafval gelijk is (bijvoorbeeld binnen 0,015 absorptie-eenheden) aan die van de gedeïoniseerde H2O die wordt gebruikt om de kolom te wassen. Gebruik gedeïoniseerd water tot nul (d.w.z. leeg) de spectrofotometer.</li>
	<li>Desorbeer de HFA door back-elutie door 0,1 M NaOH via de onderkant van de kolom te pompen met behulp van de peristaltische pomp. Gebruik een debiet van 35 – 40 ml/min. Vang het pompafval (de Na-fulvate in een voldoende grote schone container (bijv. 2 L Erlenmeyer). OPMERKING: De meeste HFA-adsorbeert aan de bovenkant van het DAX-8 harsbed. Desorptie door de 0,1 M NaOH vanaf de onderkant van de kolom in te brengen, minimaliseert de hoeveelheid van 0,1 M NaOH die nodig is om de FA volledig te desorberen.</li>
	<li>Alle HFA is gedesorbeerd wanneer de absorptie van het kolom-effluent gelijk is aan de absorptie van 0,1 M NaOH-influent bij 350 nm. Gebruik 0,1 M NaOH als spectrofotometrische blanco. Voeg het ingenomen effluent toe om de absorptie van de gedesorbeerde FA-oplossing te controleren om ervoor te zorgen dat alle FA wordt opgevangen.</li>
</ol>10. HFA-ontsteven door protonering
<ol><li>Passeer de Na-fulvate-oplossing herhaaldelijk, door zwaartekrachttoevoer, door sterke kation H+-uitwisselingshars (Materiaaltafel) in een kolom van 5 × 50 cm, met glazen frit om de hars vast te houden, totdat de elektrische geleidbaarheid van het effluent is <120 μS/cm, zoals gemeten met een elektrische geleidbaarheidsmeter. Voorafgaand aan elke pas moet de H+-wisselhars worden opgeknapt zoals beschreven in sectie 11.<ol>
<li>Om ervoor te zorgen dat alle FA na de einddoorgang uit de hars wordt verwijderd, wast u de hars met gedeïoniseerd water totdat de absorptie van effluent bij 350 nm hetzelfde is (bijvoorbeeld binnen 0,015 absorptie-eenheden) als het gedeïoniseerde water dat wordt gebruikt om de kolom te wassen. Gebruik gedeïoniseerde H2O als spectrofotometrische blanco. Voeg de was en eventuele effluentporties toe om de absorptie aan de gezuiverde FA-oplossing te controleren. Om te helpen bij het verwijderen van alle FA, kan de hars meerdere keren worden geroerd (bijvoorbeeld met behulp van een lange glazen of plastic staaf).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Concentreer de FA tot een volume van ongeveer 15 ± 2 ml met behulp van een roterende verdamper bij 55 °C.</li>
	<li>Breng het 15 ml FA-concentraat volledig over in een plastic centrifugebuis van 50 ml en droog bij 60±3 °C tot een constante droogheid in een droogoven. Vriesdrogen is een alternatief voor ovendrogen. Breng na het drogen de buis over op een exsiccator om af te koelen.<ol>
<li>Verwijder FA uit de buis door de zijkanten en bodem van de buis met een spatel te schrapen en weeg de verzamelde FA op voorgehard weegpapier. Dit materiaal is de "Extracted FA" (WEFA).</li>
		<li>Bepaal de asverhouding (ASHrat) van geëxtraheerde FA zoals beschreven in stap 6 voor HA en bereken de asverhouding met formule 1.2. Bepaal het gewicht van de geëxtraheerde FA zonder as (WPFA) met behulp van Formule 1.3, waarbij de WEFA wordt vervangen door het gewicht van WEHA. Bepaal ten slotte het % zuivere FA in het monster met behulp van Formule 1.4 ter vervanging van WPHA door WPFA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. DAX-8 harsregeneratie
<ol><li>Regenereereer de DAX-8-hars door 0,1 M HCl (8,33 ml geconcentreerd HCl / 1000 ml gedeïoniseerd H2O) met een stroomsnelheid van 35 - 40 ml / min door de bodem van de kolom te pompen totdat de pH van het effluent gelijk is aan de pH van het influent. Gebruik de peristaltische pomp om alle reagentia door de DAX-8 kolom te pompen tijdens de regeneratie.</li>
	<li>Spoel de kolom met DI-water door deze in de bovenkant van de kolom te pompen totdat de pH van het effluent gelijk is aan de pH van het influent (d.w.z. DI-water).</li>
</ol>12. H+-kationenuitwisseling harsregeneratie
<ol><li>Regenereer de H+ kationenuitwisselingshars in een batchproces door de hars in een groot bekerglas (bijv. 4 L plastic bekerglas) te gieten, meerdere keren te spoelen door de hars te bedekken met DI H2O, te mengen en vervolgens het water af te gieten.</li>
	<li>Bedek de hars met 1 M HCl (83,3 ml geconcentreerd HCl/1000 ml eindvolume DI-water). Laat minimaal 2 uur staan met af en toe roeren (bijvoorbeeld eens in de 30 minuten).</li>
	<li>Verwijder het overtollige zuur uit de hars door het zuur af te gieten en de hars te bedekken met DI-water. Roer krachtig met een roerstaaf gedurende 15 s, laat de hars dan op de bodem van de kolf vallen en giet dan het water af. Herhaal het proces totdat de elektrische geleidbaarheid van het spoelwater is ≤ 0,7 μS/cm.</li>
	<li>Laad de geregenereerde hars terug in de kolom. Dek af met gedeïoniseerd H2O om ervoor te zorgen dat de hars nat blijft tussen gebruik.</li>
</ol>

<ol>
	<li>DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+origin+and+formation+for+molecular+components+of+humic+acids+in+soils.">Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).</li><li>Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+black+carbon-like+and+alicyclic+aliphatic+compounds+by+hydroxyl+radical+initiated+degradation+of+lignin.">Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin.</a> Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).</li><li>Baldock, J. A., Skjemstad, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+soil+matrix+and+minerals+in+protecting+natural+organic+materials+against+biological+attack.">Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack.</a> Organic Geochemistry. 31 (7-8), 697-710 (2015).</li><li>Kallenbach, C. M., Frey, S. D., Grandy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+microbial-derived+soil+organic+matter+formation+and+its+ecophysiological+controls.">Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls.</a> Nature Communications. 7, 13630 (2016).</li><li>Schaeffer, A., Nannipieri, P., Kastner, M., Schmidt, B., Botterweck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+humic+substances+to+soil+organic+matter-microbial+contributions.+In+honour+of+Konrad+Haider+and+James+P.+Martin+for+their+outstanding+research+contributionns+to+soil+science.">From humic substances to soil organic matter-microbial contributions. In honour of Konrad Haider and James P. Martin for their outstanding research contributionns to soil science.</a> Journal of Soils Sediments. 15 (9), 1865-1881 (2015).</li><li>Stevenson, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2e. , (1994).</li><li>Weber, J., Chen, Y., Jamroz, E., Miano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preface:+humic+substances+in+the+environment.">Preface: humic substances in the environment.</a> Journal of Soils and Sediments. 18, 2665-2667 (2018).</li><li>Schnitzer, M., Page, A. L., Miller, R. H., Keeny, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+matter+characterization.">Organic matter characterization.</a> Methods of soil analysis, part 2: Chemical and microbiological properties. , 581-594 (1982).</li><li>Mehlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photometric+determination+of+humic+matter+in+soils:+A+proposed+method.">Photometric determination of humic matter in soils: A proposed method.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 15 (12), 1417-1422 (1984).</li><li>Lamar, R. T., Talbot, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+comparison+of+humid+acid+test+methods.">Critical comparison of humid acid test methods.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 50 (15-16), 2309-2322 (2009).</li><li>Swift, R. S., Sparks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+matter+characterization.">Organic matter characterization.</a> Methods of soil analysis, part 3: Chemical methods. , 1011-1069 (1996).</li><li>Lamar, R. T., Olk, D. C., Mayhew, L., Bloom, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+standardized+method+for+quantitation+of+humic+and+fulvic+acids+in+humic+ores+and+commercial+products.">A new standardized method for quantitation of humic and fulvic acids in humic ores and commercial products.</a> Journal of the AOAC International. 97 (3), 722-731 (2014).</li><li>International Organization of Standards. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizers+and+soil+conditioners-Determination+of+humic+and+hydrophobic+fulvic+acids+concentrations+in+fertilizer+materials.">Fertilizers and soil conditioners-Determination of humic and hydrophobic fulvic acids concentrations in fertilizer materials.</a> International Organization of Standards. , (1982).</li><li>Liam, L. E., Serben, T., Cano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravimetric+quantification+of+hydrophobic+filmic+acids+in+lignite+material+using+acetone.">Gravimetric quantification of hydrophobic filmic acids in lignite material using acetone.</a> Journal of the AOAC International. 102 (6), 1901-1907 (2019).</li><li>House, W. A., Zhmud, B. V., Orr, D. R., Lloyd, G. K., Irons, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+pesticides+by+colloids.+Final+Report.">Transportation of pesticides by colloids. Final Report.</a> Institute of Freshwater Ecology. National Environment Research Council. , (1998).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

De eerste stappen van extractie en isolatie van de HA in deze methode zijn relatief eenvoudig. Omdat de isolatie van de HFA kolomchromatografie omvat, gaat het verkrijgen van herhaalbare resultaten gepaard met strikte naleving van de details van elke stap en oefening. Met name een juiste bereiding van de harsen is van primair belang. Het is uiterst belangrijk dat de polymethylmethacrylaat DAX-8 hars goed wordt bereid en verpakt. De juiste verpakking van de hars heeft invloed op zowel de opbrengst als de kwaliteit van de HFA. Als channeling bestaat, zal noch de voorbehandeling (d.w.z. verzuring) noch de adsorptie van HFA volledig zijn en zal de scheiding tot onnauwkeurige resultaten leiden. Als kanalen of ruimtes in de hars worden waargenomen voordat het monster wordt geladen, moet de kolom worden verwijderd en geschud om de harsparels opnieuw te verdelen, door ze zonder kanalen te laten bezinken, en vervolgens opnieuw worden verpakt door schone DI H2O door de hars te pompen. Bovendien, zoals vermeld in het protocol, zal het handhaven van een volume vloeistof boven de hars bij het laden van de FF op de hars, de FF in staat stellen om te mengen voordat de hars wordt binnengedrongen en resulteren in een effectievere adsorptie. Voor de sterke kation H+-uitwisselingshars (Table of Materials) kan volledige regeneratie niet worden overhaast. De Na+/H+ uitwisseling kost tijd en daarom kan dit het beste in een bulkbehandeling worden gedaan, zodat de hars kan worden gemengd terwijl deze opnieuw wordt aangezuurd. Het mengen van de hars tijdens het spoelen met DI H2O helpt de overtollige HCl te verwijderen. Bij het optrekken van de aangezuurde hars om overtollig zuur te verwijderen, helpt het mengen van de hars bij het verwijderen van de HCl. Het is uiterst belangrijk om het zuur te verwijderen tot het punt waar een elektrische geleidbaarheid van ≤ 0,7 μS / cm wordt bereikt. Zo niet, dan wordt de HCl overgedragen met de HFA.
Ten slotte, bij het desorberen van de HFA uit de DAX-8-hars, zodra de absorptie van het influent gelijk is aan de absorptie van het effluent, is het een goede gewoonte om de kolom een paar uur te laten zitten om te zien of er extra HFA vrijkomt. Als dat zo is, zal het worden gezien als een vergeling van de vloeistof boven de hars. Als dit gebeurt, kan de extra HFA worden verwijderd door voortdurende desorptie totdat de absorpties van influent/effluent weer gelijk zijn.
Een van de nadelen van de HFA-isolatie is dat het hele proces tijdrovend is. De volledige desorptie van HFA uit de DAX-8-hars en volledige verwijdering uit de H+-uitwisselingshars resulteren beide in een aanzienlijk volume HFA dat moet worden verminderd door roterende verdamping. Dit is zeker een knelpunt in de analyse. In een poging om deze tijd te verkorten, is voorgesteld om de HFA uit de DAX-8-hars te desorberen met aceton in plaats van 0,1 M NaOH14. De auteurs beweerden dat door 50% aceton als desorbent te gebruiken in plaats van NaOH, een vergelijkbaar HFA-resultaat werd verkregen en de DAX-8 voldoende werd geregenereerd en dus de H + -uitwisselingsstap kon worden geëlimineerd. Deze modificatie resulteerde in een sterk kortere analysetijd als gevolg van een verminderd geproduceerd volume en een snellere roterende verdamping van aceton in vergelijking met water. Deze wijziging deservers verder bestuderen.
Deze methode is beperkt tot de analyse van organisch materiaal dat het proces van humificatie heeft ondergaan, en voor het geval van turf en zachte steenkool, de verdere processen van turfvorming en zowel turfvorming als coalificatie, respectievelijk. Humificatie is het proces waarbij dood, voornamelijk plantaardig materiaal, wordt afgebroken door een opeenvolging van microben die steeds recalcitrantere substraten consumeren en modificeren. Abiotische processen nemen ook deel aan ontledings- en hersynthesereacties. Humificatie resulteert uiteindelijk in de productie van relatief recalcitrante materialen bestaande uit heterogene mengsels van duizenden moleculen die een reeks molecuulgewicht vormen en koolstof-, zuurstof- en waterstofgehalten die HS vormen. GS worden verder aangepast door turfvorming en coalificatie. Daarom is deze methode niet geschikt voor plantaardige materialen die zijn gemodificeerd door chemische processen. Lignosulfonaat wordt bijvoorbeeld veel gebruikt als een HFA-overspelig middel. Lignosulfonaat is een bijproduct van het sulfietpulpproces. Daarom is dit materiaal niet geproduceerd door het proces van humificatie. Daarnaast zijn er veel stoffen die binden aan de DAX-8 hars. DAX-8-hars is bijvoorbeeld gebruikt om pesticiden uit oplossing te adsorberen15. Het is duidelijk dat pesticiden geen HS zijn. Het binden van een materiaal aan DAX-8-hars rechtvaardigt dus niet de bewering dat het een HFA is. De vereisten zijn zowel productie door humificatie als binding aan DAX-8-hars.
Naarmate er meer wordt geleerd over de bijdrage van de verschillende componenten van GS in verschillende toepassingen, kan het voordelig worden om GS verder te fractioneren en zo de methode dienovereenkomstig aan te passen. Zoals die bestaat, kwantificeert de methode de HYFA niet. Deze fractie kan echter ook actief zijn, bijvoorbeeld in de biostimulatie van planten, waarbij de hele FF over het algemeen wordt toegepast in landbouwbehandelingen in plaats van gezuiverde HFA.

Humusstoffen (HS) zijn dynamische residuen die het gevolg zijn van de microbiële afbraak en transformatie van dode plantenweefsels1,2,3 aangevuld met microbiële bijproducten en biomassa3,4,5 via een proces dat humificatie wordt genoemd6. HS zijn aanwezig in bodems, natuurlijke wateren, meersedimenten, turf, zachte kolen en humusschalie en vertegenwoordigen naar schatting 25% van de totale organische koolstof op aarde7. Deze stoffen zijn complexe mengsels van duizenden unieke moleculen die worden gefractioneerd in drie hoofdfracties op basis van hun verschillende oplosbaarheid in sterk basische en zure waterige oplossingen. Deze fracties zijn humuszuren (HAs), die de alkali oplosbare maar in zuur onoplosbare fractie vormen; fulvinezuren (VA's), de fractie oplosbaar in zowel alkali als zuur; en de huminefractie, die bij alle pH-waarden onoplosbaar is6,8. De fulvinefractie (FF) wordt verder onderverdeeld in de hydrofobe FA (HFA) en hydrofiele (HyFA) fracties. Deze fracties worden gedefinieerd als het deel van de FF dat bindt aan een hydrofobe DAX-8 hars (HFA) en het deel dat niet bindt aan de hars (HyFA).
HS wordt steeds vaker gebruikt in de landbouw, waar ze op grote schaal worden gebruikt als biostimulanten voor gewassen, in de veehouderij, met name als toevoegingsmiddel voor veevoer, in de mijnbouw in boorslib en milieusanering als elektronenshuttles. Ook het onderzoek naar het gebruik van HS in medische toepassingen bij mensen neemt toe.
Er bestaan veel methoden voor de kwantificering van HA en FA. De meeste van deze methoden zijn echter niet nauwkeurig of nauwkeurig. De twee meest gebruikte methoden voor de bepaling van HA in de VS zijn bijvoorbeeld de colorimetrische methode9 en de methode van het California Department of Food and Agriculture (CDFA), waarvan beide de hoeveelheid HA in een reeks erts- en extractbronnen uit het westen van de VS en Canada hebben overschat10. De colorimetrische of spectrofotometrische methode is onnauwkeurig omdat deze afhankelijk is van de absorptie van alkalische extracten die, naast HA, FA en andere chromoforen omvatten die allemaal absorberen op de gebruikte golflengte en de standaard is niet representatief voor de materialen die worden getest10. De CDFA-methode is niet nauwkeurig omdat deze geen HA-concentraties op een asvrije basis levert. Omdat verschillende ertsen verschillende hoeveelheden as hebben, waarvan sommige worden meegevoerd met de extractie en het extractieproces zelf as toevoegt, levert deze methode geen nauwkeurige waarde op voor HA-concentraties10. Als antwoord op de behoefte aan een nauwkeurige en nauwkeurige methode, werd in 2014 een gestandaardiseerde gravimetrische procedure gepubliceerd op basis van de door11 beschreven procedure om de kwantificering van zowel HA als FA op een asvrije basis aan te pakken12. Deze methode werd vervolgens, met kleine wijzigingen, in 2018 door de International Organization for Standardization (ISO) aangepast onder Meststoffen en bodemverbeteraars als "Bepaling van humus- en hydrofobe fulvinezurenconcentraties in kunstmestmaterialen"13.
Dit artikel schetst het protocol voor extractie en kwantificering van humus- en hydrofobe fulvinezuren en geeft details over de nauwkeurigheid en precisie van de gegevens die uit de methode worden geproduceerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">Amberlite IR 120 H+-exchange resin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10322</td>
			<td style="width:167px;">H+ form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:121px;">Ohaus</td>
			<td style="width:161px;">PA214</td>
			<td style="width:167px;">w/ glass draft shield</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">Allegra X-14</td>
			<td style="width:167px;">minimum 4300 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">To fit rotor selected</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceramic Combustion Crucibles</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">Z247103</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chromatography column for DAX-8</td>
			<td style="width:121px;">Diba</td>
			<td style="width:161px;">Omnifit 006EZ-50-25-FF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chromatography column for IR 120</td>
			<td style="width:121px;">Chemglass</td>
			<td style="width:161px;">CG-1187-21 2 in. by 24 in.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dessicator</td>
			<td style="width:121px;">Capitol Scientic</td>
			<td style="width:161px;">Kimax 21200-250</td>
			<td style="width:167px;">Vacuum type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drying Oven</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Isotemp</td>
			<td style="width:167px;">Precision&#177;3&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrical conductivity meter</td>
			<td style="width:121px;">HM Digital</td>
			<td style="width:161px;">EC-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:121px;">Amazon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">1L, 2L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl concentrated</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">320331</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic Stir Plate</td>
			<td style="width:121px;">Barnstead-Thermolyne</td>
			<td style="width:161px;">Dataplate 721</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic Stir bars</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">These can be obtained at many outlets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Muffle Furnace</td>
			<td style="width:121px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:161px;">Thermolyne Type 47900</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">795429</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:121px;">Praxair</td>
			<td style="width:161px;">UNI1066</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:121px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:161px;">Masterflex 7518-00</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perstaltic tubing</td>
			<td style="width:121px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:161px;">Masterflex Pharmed 06508-17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pH meter</td>
			<td style="width:121px;">Oakton Instruments</td>
			<td style="width:161px;">WD-35618--03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:121px;">Buchi</td>
			<td style="width:161px;">R-210/R-215</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">Healthcare SCiences</td>
			<td style="width:161px;">Ultrospec II</td>
			<td style="width:167px;">Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of &#177;1 nm and reproducibility of &#177;0.5 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of humic and fulvic acids in humate ores, doc, humified materials and humic substance-containing commercial products

Het doel van deze methode is te zorgen voor een nauwkeurige en nauwkeurige concentratie humus (HA) en/of fulvinezuren (FA) in zachte kolen, humusertsen en leisteen, turf, compost en humussubstantiehoudende handelsproducten. De methode is gebaseerd op de alkalische extractie van testmaterialen, met behulp van 0,1 N NaOH als extractiemiddel, en scheiding van de alkalische oplosbare humusstoffen (HS) van niet-oplosbare producten door centrifugering. De pH van het gecentrifugeerde alkalische extract wordt vervolgens aangepast tot pH 1 met conc. HCl, wat resulteert in precipitatie van de HA. De neergeslagen HA worden gescheiden van de fulvinefractie (FF) (de fractie van HS die in oplossing achterblijft) door centrifugatie. De HA wordt vervolgens in de oven of gevriesdroogd en het asgehalte van de gedroogde HA bepaald. Het gewicht van het zuivere (d.w.z. asvrije) HA wordt vervolgens gedeeld door het gewicht van het monster en de resulterende fractie vermenigvuldigd met 100 om het ha-ƒ%-ha in het monster te bepalen. Om het FA-gehalte te bepalen, wordt de FF geladen op een hydrofobe DAX-8-hars, die de FA-fractie adsorbeert, ook wel het hydrofobe fulvinezuur (HFA) genoemd. De resterende niet-fulvinezuurfractie, ook wel de hydrofiele fulvinefractie (HyFF) genoemd, wordt vervolgens verwijderd door de hars te wassen met gedeïoniseerd H2O totdat al het niet-geabsorbeerde materiaal volledig is verwijderd. De FA wordt vervolgens gedesorbeerd met 0,1 N NaOH. Het resulterende Na-fulvate wordt vervolgens geprotoneerd door het over een sterke H + -uitwisselingshars te laten gaan. De resulterende FA is oven- of gevriesdroogd, het asgehalte bepaald en de concentratie in het monster berekend zoals hierboven beschreven voor HA.

Prestatiegegevens voor de methode zijn opgenomen in de tabellen 1 – 5. De precisie van de methode voor extractie van HA en FAH uit vloeibare commerciële monsters met zeer verschillende concentraties HA en FHA is weergegeven in tabel 1.
De relatieve standaarddeviaties (RSD's) voor HA waren lager dan die voor HFA, maar de gemiddelde HFA RSD over de drie vloeistofmonsters was op 6,83%, wat wijst op een hoge mate van precisie. De Horwitz-ratio (HorRat) is een genormaliseerde prestatieparameter die de geschiktheid aangeeft van een analysemethode met betrekking tot laboratoriumprecisie. Hier werd het gebruikt voor intra-laboratorium precisie. Waarde < 0,5 kan wijzen op een niet nader genoemde gemiddelde of een hoge mate van ervaring met de methode. Waarden > 2.0 duiden op heterogeniteit van testmonsters, de noodzaak van methodeoptimalisatie of uitgebreidere training, het werken onder de detectiegrens of een niet-toepasselijke methode. Voor de analyse van vloeistofmonsters werd de HorRat slechts > 2 voor een van de HFA-analyses (tabel 1).
Nauwkeurige gegevens voor de extractie van HA en HFA uit drie humusertsmonsters zijn opgenomen in tabel 2. Nogmaals, met uitzondering van de HFA gewonnen uit Erts 2 en de HA uit Erts 3, waren alle HorRat's onder de 2. Dit toont een hoge mate van precisie van deze methode voor extractie van HA en HFA voor humusertsmonsters.
Fabrikanten van biostimulanten voor planten formuleren vaak producten die HS bevatten naast andere ingrediënten zoals zeewier, anorganische meststoffen, kolen of melasse. Tabel 3 geeft de resultaten weer van een analyse van de opname van dit soort additieven op de precisie van de methode. Geen van de additieven heeft de terugwinning van HA of HFA significant beïnvloed (tabel 3).
Tabel 4 en tabel 5 rapporteren de terugvorderingen van respectievelijk HA en HFA uit vloeibare monsters die commerciële producten met zeer lage concentraties simuleerden. De terugvorderingen waren uitstekend en varieerden van 88% tot 97% voor HA (tabel 4) en 92% en 104% voor HFA (tabel 5). De gemiddelde terugvorderingen voor HA en HFA waren respectievelijk 93% en 97%, en % RSD voor beide HS was minder dan 5%. Hoewel de precisie uitstekend is, geven deze gegevens de noodzaak aan om laboratoriumreplicaties uit te voeren. De methodedetectiegrens (MDL) en de methodekwantificeringsgrens waren 4,62 en 1,47 mg/l voor HA en 4,8 en 1,53 mg/l voor HFA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="8">Humusstoffen, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Materiaal</td>
			<td colspan="2">L16</td>
			<td colspan="2">L17</td>
			<td colspan="3">L2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 1</td>
			<td>1.44</td>
			<td>17</td>
			<td>6.59</td>
			<td>7.76</td>
			<td>0.36</td>
			<td colspan="2">4.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 2</td>
			<td>1.39</td>
			<td>16.03</td>
			<td>6.25</td>
			<td>7.79</td>
			<td>0.42</td>
			<td colspan="2">4.93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 3</td>
			<td>1.34</td>
			<td>16.44</td>
			<td>6.02</td>
			<td>7.55</td>
			<td>0.4</td>
			<td colspan="2">4.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 4</td>
			<td>1.54</td>
			<td>16.75</td>
			<td>6.2</td>
			<td>7.69</td>
			<td>0.33</td>
			<td colspan="2">4.53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bedoelen</td>
			<td>1.43</td>
			<td>16.56</td>
			<td>6.27</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0.38</td>
			<td colspan="2">4.6</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">SD</td>
			<td rowspan="2">0.09</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
			<td>0</td>
			<td rowspan="2">0.11</td>
			<td rowspan="2">0.04</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">0.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>6.29</td>
			<td>2.53</td>
			<td>3.8</td>
			<td>1.39</td>
			<td>10.4</td>
			<td colspan="2">4.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hor Rat(r)</td>
			<td>1.58</td>
			<td>0.72</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.47</td>
			<td>2.31</td>
			<td colspan="2">1.55</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">
een De extractiecondities waren 1 g in 1 L 0,1 M NaOH.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Precisie van de methode bij extractie en kwantificering van HA en HFA uit vloeibare commerciële monsters. De extractiecondities waren 1 g in 1 L 0,1 M NaOH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Humusstoffen, %</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Erts 1</td>
			<td colspan="2">Erts 2</td>
			<td colspan="2">Erts 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Materiaal</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>67.4</td>
			<td>1.31</td>
			<td>27.01</td>
			<td>1.55</td>
			<td>8.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 2</td>
			<td>1.69</td>
			<td>67.63</td>
			<td>1.25</td>
			<td>27.48</td>
			<td>1.41</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 3</td>
			<td>1.63</td>
			<td>67.1</td>
			<td>1.27</td>
			<td>27.34</td>
			<td>1.47</td>
			<td>8.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 4</td>
			<td>1.77</td>
			<td>67.59</td>
			<td>1.55</td>
			<td>26.89</td>
			<td>1.51</td>
			<td>7.98</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bedoelen</td>
			<td>1.71</td>
			<td>67.53</td>
			<td>1.35</td>
			<td>27.18</td>
			<td>1.49</td>
			<td>8.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.14</td>
			<td>0.28</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>3.7</td>
			<td>1.39</td>
			<td>10.33</td>
			<td>1.02</td>
			<td>4.02</td>
			<td>9.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>HorRat(r)</td>
			<td>0.99</td>
			<td>0.66</td>
			<td>2.71</td>
			<td>0.42</td>
			<td>1.07</td>
			<td>3.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Precisie van de methode bij extractie en kwantificering van HA en HFA uit humusertsen. De extractiecondities waren 1 g monster in 1 L 0,1 M NaOH. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Nabootsen</td>
			<td>Overspelige</td>
			<td>HA, %</td>
			<td>F.F., %</td>
			<td>Relatieve terugwinning HA, %</td>
			<td>Relatieve terugwinning HFA, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Geen</td>
			<td>81.61</td>
			<td>12.86</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Geen</td>
			<td>80.16</td>
			<td>12.78</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Zeewier</td>
			<td>80.21</td>
			<td>12.85</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Zeewier</td>
			<td>80.72</td>
			<td>12.79</td>
			<td>99.5</td>
			<td>99.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Mest</td>
			<td>80.25</td>
			<td>12.98</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Mest</td>
			<td>79.57</td>
			<td>123.77</td>
			<td>98.8</td>
			<td>101.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Steenkool</td>
			<td>78.79</td>
			<td>12.92</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Steenkool</td>
			<td>81.27</td>
			<td>12.84</td>
			<td>98.9</td>
			<td>101.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Melasse</td>
			<td>79.38</td>
			<td>12.99</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Melasse</td>
			<td>81.02</td>
			<td>12.72</td>
			<td>99.2</td>
			<td>100.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bedoelen</td>
			<td></td>
			<td>80.3</td>
			<td>12.85</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>0.885</td>
			<td>0.09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
een eindconcentratie van FA + HA van 2,5 g/l toegevoegd aan 0,1 M NaOH. (gegevens afkomstig van Lamar et al., 2015)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Effect van overspeligen op kwantificering van HA en HFA van een Gascoyne leonardiet. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2015)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">HA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorbeeld-ID</td>
			<td>Geëxtraheerd, mg</td>
			<td>Teruggewonnen, mg</td>
			<td>Teruggewonnen, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>24.6</td>
			<td>23.7</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>22.6</td>
			<td>19.9</td>
			<td>88.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.2</td>
			<td>23.6</td>
			<td>93.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>22.5</td>
			<td>21.5</td>
			<td>95.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>23.9</td>
			<td>21.8</td>
			<td>91.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>23.2</td>
			<td>20.8</td>
			<td>89.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>24</td>
			<td>23.2</td>
			<td>96.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bedoelen</td>
			<td>23.7</td>
			<td>22.1</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>1.01</td>
			<td>1.52</td>
			<td>3.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>4.35</td>
			<td>6.88</td>
			<td>3.67</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">(gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4. Herstel van HA van spiked blanks. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">FA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorbeeld-ID</td>
			<td>Geëxtraheerd, mg</td>
			<td>Teruggewonnen, mg</td>
			<td>Teruggewonnen, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19.9</td>
			<td>19</td>
			<td>95.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>23.1</td>
			<td>22.9</td>
			<td>99.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>20.7</td>
			<td>19.4</td>
			<td>93.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20.5</td>
			<td>19.8</td>
			<td>96.39</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>21.6</td>
			<td>103.85</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>21.9</td>
			<td>20.1</td>
			<td>91.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>22.7</td>
			<td>22.3</td>
			<td>98.24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bedoelen</td>
			<td>21.37</td>
			<td>20.73</td>
			<td>96.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>1.21</td>
			<td>1.53</td>
			<td>3.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>5.64</td>
			<td>7.36</td>
			<td>4.07</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">(Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5. Herstel van HFA van spiked blanks. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products at JoVE.com

Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products

Deze methode biedt een gravimetrische kwantificering van humusstoffen (bijv. humus- en fulvinezuren) op asvrije basis, in droge en vloeibare materialen uit zachte steenkool (d.w.z. geoxideerde en niet-geoxideerde bruinkool en subbitumineuze steenkool), humate-ertsen en schalies, turf, compost en commerciële meststoffen en bodemaanpassingen.

Kwantificering van humus- en fulvinezuren in Humate-ertsen, DOC, onttomerde materialen en humussubstantiebevattende commerciële producten

The purpose of this method is to provide an accurate and precise concentration of humic (HA) and/or fulvic acids (FA) in soft coals, humic ores and ...

De nieuwe standaardmethode voor kwantificering van humuszuren biedt een nauwkeurigere en nauwkeurigere analyse in vergelijking met de bestaande regulatorisch aanvaarde methoden, en biedt ook een standaardmethode voor zuivere hydrofobe fulvinezuurkwantificering. Het voordeel van dit protocol is dat het een gravimetrische analyse van humus- en hydrofobe fulvinezuurconcentraties op een asvrije basis biedt, en het extractieproces is geoptimaliseerd om de hoogste terugwinningen van zowel humus- als fulvinezuren uit monsters te verkrijgen. De procedure wordt gedemonstreerd door Ryan Fountain, een analytisch chemicus van ons humuschemielaboratorium.Om een vast monster te bereiden, gebruikt u een vijzel en stamper om ongeveer vijf gram van het te analyseren monster te pletten totdat 100% van het goed gemengde monster door een Amerikaanse standaardzeef kan gaan, maaswijdte nummer 200. Om gravimetrisch het vochtgehalte van het poeder te bepalen, brengt u ongeveer twee gram van het monsterpoeder over in een voorgewogen aluminium weegboot en registreert u de massa van de boot en het monster. Plaats vervolgens de weegboot 24 uur in een droogoven op 102 graden Celsius.Plaats de boot de volgende dag in een exsiccator om ten minste één uur af te koelen voordat u de massa van de weegboot en het gedroogde monster weegt en registreert, en gebruik vervolgens de formule om het vochtgehalte te bepalen zoals aangegeven. Om een extractie uit een vast monster uit te voeren, weegt u ongeveer 2,5 gram van het resterende monster en noteert u het gewicht tot op vier decimalen. Laad het monster vervolgens in een Erlenmeyer van één liter en spoel de weegboot af met gedeïoniseerd water om al het erts te verwijderen.Vul het bekerglas tot één liter met 0,1-molair natriumhydroxide en voeg een magnetische roerstaaf van vijf tot zeven centimeter toe om het monster snel te roeren met 300 tot 400 omwentelingen per minuut op een roerplaat. Wanneer het monster grondig is gemengd, evacueert u de kopruimte van de kolf met stikstofgas, sluit u de opening van de kolf af met een luchtdicht deksel en plaatst u de kolf op een roerplaat om gedurende 16 tot 18 uur met 300 tot 400 omwentelingen per minuut te mengen. Schud het monster voor de extractie van vloeibaar materiaal grondig om ervoor te zorgen dat de testvloeistof homogeen wordt gemengd, met inbegrip van eventuele resten die op de bodem van de recipiënt zijn gevallen.Weeg ongeveer vijf gram van de testvloeistof af en noteer het gewicht tot op vier decimalen. Voeg vervolgens de vloeistof toe aan een maatcilinder van één liter en vul de cilinder met 0,1-molair natriumhydroxide tot een eindvolume van één liter. Gebruik een magnetische roerstaaf om het monster snel te mengen zoals aangetoond totdat het testmonster volledig is gemengd voordat het mengsel in een Erlenmeyer van één liter wordt overgebracht, maak vervolgens de kopruimte vrij met stikstofgas en roer de kolfinhoud gedurende één uur met 300 400 omwentelingen per minuut, zoals aangetoond.Om niet-oplosbare materialen uit alkalische extracten te verwijderen, brengt u aan het einde van de roerincubatie het mengsel over naar geschikte centrifugebuizen en centrifugeert u het volledige monstervolume gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 4. 921x G. Verzamel aan het einde van de centrifugatie het alkalische supernatant met de humuszuur- en fulvinedractie, die het hydrofobe fulvinezuur bevat, in een schone Erlenmeyer van één liter met een magnetische roerstaaf. Voor humuszuurprecipitatie van de fulvinefractie, terwijl het verzamelde alkalische extract met 300 tot 400 omwentelingen per minuut op een roerplaat roert, plaatst u een pH-sonde in het middelste gedeelte van de oplossing en voegt u geconcentreerd zoutzuur druppelsgewijs toe totdat een stabiele pH van pH 1,0 plus of min 0,1 is bereikt.Zodra de pH stabiel is, verwijdert u de sonde en roerstaaf, spoelt u ze af met gedeïoniseerd water en sluit u de kolf af met een luchtdichte afdekking. Laat de kolf één tot zes uur staan totdat het neergeslagen humuszuur op de bodem is neergedaald voordat het extract en het neergeslagen humuszuur gedurende één uur op 4.921x G worden gecentrifugeerd. Giet aan het einde van de centrifugatie de fulvinefractie-bevattende supernatanten in een schone Erlenmeyer van één liter en sluit de kolf af met een luchtdicht deksel.Plaats de humuszuurhoudende centrifugebuizen gedurende 24 uur in een droogoven van 100 graden Celsius en zorg ervoor dat de deksels los zitten of worden verwijderd om drogen te garanderen. Koel de buizen na het drogen af in een exsiccator tot ze op kamertemperatuur zijn. Gebruik na het afkoelen een spatel om het residu van elke buis over te brengen in een enkele geteerde weegboot om de massa van het geëxtraheerde humuszuurmonster te bepalen.Om het asgehalte in het monster te bepalen, brengt u ongeveer 30 milligram van het gedroogde humuszuur over in een schone, vooraf gewogen keramische schaal om de massa van het weegmonster en de schaal te bepalen. Verbrand vervolgens het humuszuur twee uur lang in een moffeloven op 600 graden Celsius voordat je het gerecht afkoelt in de exsiccator. Eenmaal afgekoeld, weeg het gerecht en gebruik de formule om de asverhouding te berekenen.Om de uiteindelijke massa van het zuivere humuszuur te bepalen, gebruikt u de formule om te corrigeren voor het asgehalte. Gebruik vervolgens de formules om de zuivere humuszuurconcentratie te bepalen. Om een nieuwe, lagedruk polymethylmethacrylaat DAX8 hars-verpakte chromatografiekolom te bereiden, weekt u de hars twee uur in de methanol in een bekerglas voordat u de hars grondig spoelt met gedeïoniseerd water totdat alle methanol is verwijderd.Verwijder vervolgens eventuele kleine harsdeeltjes die op het water drijven. Eenmaal grondig gespoeld, giet u de gespoelde of geregenereerde hars in een glazen chromatografiekolom van 5 bij 25 centimeter voorzien van een eindstuk met een frit van 10 micron voor harsbedondersteuning, waarbij u 2,5 tot 5 centimeter aan de bovenkant van de kolom laat en het bovenste stuk op de kolom vervangt. Om een eerder gebruikte hars op te knappen of een vers gewassen nieuwe hars te bereiden, gebruikt u de peristaltische pomp om 0,1-molair zoutzuur met een debiet van 35 tot 40 milliliter door de onderkant van de kolom te pompen totdat de pH van het effluent gelijk is aan de pH van het influent, en pomp vervolgens gedeïoniseerd water in de bovenkant van de kolom totdat de pH van het effluent gelijk is aan de pH van het influent.Zodra het harsbed is verpakt, gebruikt u een peristaltische pomp om de fulvinerefractie onder lage druk via de bovenkant van de kolom met een debiet van 35 tot 40 milliliter op de kolom te laden. Zodra de fulvinefractie volledig op de hars is geladen, wast u de hars met gedeïoniseerd water om de niet-geadsorbeerde hydrofiele fulvinefractie te verwijderen. Was de kolom met gedeïoniseerd water totdat de absorptie van het effluent van de kolom op 350 nanometer gelijk is aan die van het gedeïoniseerde water dat wordt gebruikt om de kolom te wassen.Om de HFA te desorberen, pompt u 0,1-molair natriumhydroxide via de bodem van de kolom en vangt u het natrium fulvate-effluent van de pomp op in een schone, voldoende grote container. Alle HFA is gedesorbeerd wanneer de absorptie van het kolom-effluent gelijk is aan de absorptie van 0,1-molair natriumhydroxide-influent bij 350 nanometer. Om de HFA door protonatie te ont-asen, giet u eerst proton / kationenuitwisselingshars in een groot bekerglas en dekt en mengt u de hars meerdere keren met vers gedeïoniseerd water, waarbij u het water na elke spoeling afgiet totdat de rode kleur volledig is verwijderd.Bedek na de laatste wasbeurt de hars met één molair zoutzuur en laat het mengsel minstens twee uur staan, onder roeren om de 30 minuten. Vervang aan het einde van de verzuringsbehandeling het zuur door gedeïoniseerd water en roer krachtig met een roerstaaf gedurende 15 seconden voordat u de hars op de bodem van de kolf laat vallen en het water afgiet. Herhaal het proces totdat de elektrische geleidbaarheid van het spoelwater kleiner is dan of gelijk is aan 0,7 microSiemens per centimeter en laad de geregenereerde hars in een kolom van 5 bij 50 centimeter met een glazen frit voor het vasthouden van de hars.Bedek vervolgens de hars met vers gedeïoniseerd water en passeer herhaaldelijk het natrium fulvate door de sterke kation / proton-uitgewisselde hars door zwaartekrachttoevoer totdat de elektrische geleidbaarheid van het effluent minder dan 120 microSiemens per centimeter is. Om ervoor te zorgen dat alle FA uit de hars wordt verwijderd, wast u de hars na de laatste passage met gedeïoniseerd water totdat de absorptie van het effluent op 350 nanometer hetzelfde is als het gedeïoniseerde water dat wordt gebruikt om de kolom te wassen. Voeg de was en het eventuele effluent dat wordt gebruikt om de absorptie te controleren toe aan de gezuiverde FA-oplossing.Om te helpen bij het verwijderen van de FA, kan de hars meerdere keren worden geroerd. Gebruik een roterende verdamper bij 55 graden Celsius om de FA te concentreren tot een volume van ongeveer 15 plus of min twee milliliter en breng het volledige volume FA-concentraat volledig over naar een plastic centrifugebuis van 50 milliliter. Droog het monster tot 60 plus of min drie graden Celsius tot constante droogheid in de droogoven en breng de buis over naar de exsiccator om af te koelen.Wanneer het monster is afgekoeld, gebruikt u een spatel om de geëxtraheerde FA op een stuk voorgewogen weegpapier te schrapen en de asverhouding, het geëxtraheerde FA-gewicht en het percentage zuivere FA in het oorspronkelijke monster te bepalen, zoals aangetoond voor het humuszuur. In deze tabel worden precisiegegevens weergegeven voor de methode voor extractie van HA en HFA uit vloeibare commerciële monsters met zeer verschillende concentraties HA en HFA. De resterende standaarddeviatie voor HA was lager dan die voor HFA, maar de gemiddelde HFA-residuele standaarddeviatie over drie vloeistofmonsters was 6,83%, wat wijst op een hoge mate van precisie.De Horowitz-ratio was ook groter dan twee voor slechts één van de HFA-analyses. In deze tabel worden precisiegegevens voor de extractie van HA en HFA uit drie humusertsmonsters getoond. Net als bij de vorige analyse, met uitzondering van de HFA geëxtraheerd uit erts twee en de HA uit erts drie, waren alle Horowitz-verhoudingen lager dan twee, wat de hoge mate van precisie van deze methode voor de extractie van HA en HFA uit humusertsmonsters aantoont.In deze analyse werden geen plantaardige biostimulantadditieven waargenomen die het herstel van HA of HFA significant beïnvloeden. In deze tabellen worden de terugvorderingen van HA en HFA uit vloeibare monsters die commerciële producten met zeer lage concentraties stimuleerden, weergegeven. De terugvorderingen waren uitstekend, variërend tussen 88% en 97% voor HA en 92% en 104% voor HFA, maar ook wat de noodzaak aangeeft om laboratoriumreplicaties uit te voeren.Na deze procedure kunnen de verkregen droge humus- en fulvinezuren worden gebruikt voor karakteriseringsdoeleinden, zoals de koolstof-13 en het proton NMR-elektronenresonantie, en de massaspectrometrie met ultrahoge resolutie, naast nuttige technieken. En dit kan worden gebruikt voor de karakterisering van de humuschemie, evenals een nuttig hulpmiddel om diep te graven in de structuur-activiteitsrelatie met plantfitness en de onderliggende afweermechanismen van planten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...