Name: quantification of humic and fulvic acids in humate ores, doc, humified materials and humic substance-containing commercial products
Uploaded: 2022-03-18T13:00:00
Duration: 12 min 55 s
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Les auteurs tiennent à remercier la Humic Products Trade Association (HPTA) pour son soutien au financement des travaux qui ont abouti à la normalisation des méthodes décrites dans le présent document, ainsi que Lawrence Mayhew et les Drs Dan Olk et Paul Bloom pour le soutien technique pendant les travaux de normalisation.

1. Préparation d’échantillons solides
<ol><li>Écraser environ 5 g de l’échantillon à analyser, à l’aide d’un mortier et d’un pilon, de sorte que 100 % de l’échantillon broyé passe à travers un maillage de tamis standard américain n° 200 (c.-à-d. 74 μm) en s’assurant que la poudre est bien mélangée.</li>
	<li>Déterminez la teneur en humidité de la poudre par gravimétrie.<ol>
<li>Pesez un bateau de pesage en aluminium et enregistrez la masse (Wwb).</li>
		<li>Transférer environ 2 g de poudre d’échantillon dans le bateau de pesée et enregistrer la masse (Wws + wb).</li>
		<li>Placer le bateau de pesée dans un four de séchage pendant 24 h à 102 °C (ne pas dépasser 102 °C). Après 24 h, retirer le bateau de pesage du four de séchage et le placer dans un dessiccateur pour refroidir pendant au moins 1 h.</li>
		<li>Peser et enregistrer la masse du bateau de pesage et de la poudre d’échantillon séchée (Wds + wb).</li>
		<li>Déterminer la teneur en humidité à l’aide de la formule 1.1. Formule 1.1 Teneur en humidité de la poudre d’échantillon solide % d’humidité = ((((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Procédure d’extraction
<ol><li>Échantillons solides<ol>
<li>Peser environ 2,5 g de la poudre d’échantillon tamisée (Wsamp) dans un bateau de pesage en plastique ou en aluminium et enregistrer le poids à quatre décimales.</li>
		<li>Chargez l’échantillon dans un cylindre gradué de 1 L et remplissez le cylindre à 1 L avec 0,1 M naOH (4 g NaOH x L-1).</li>
		<li>Ajouter une barre d’agitation magnétique (p. ex., 5 à 7 cm de longueur) et remuer rapidement (c.-à-d. 300 à 400 tr/min) sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que l’échantillon soit bien mélangé.</li>
		<li>Transférer tout le contenu de la bouteille graduée dans une fiole Erlenmeyer de 1 L, évacuer l’espace de tête de la fiole avec du gaz N2 et couvrir l’ouverture de la fiole avec un couvercle étanche à l’air.</li>
		<li>Placer la fiole d’Erlenmeyer sur une plaque à remuer et mélanger à 300 - 400 tr /min pendant 16 à 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Échantillons liquides<ol>
<li>Pour les matériaux liquides, bien mélanger l’échantillon en le agitant pour s’assurer que le liquide d’essai est mélangé de manière homogène. Assurez-vous que tout résidu qui pourrait être tombé au fond du récipient est bien mélangé.</li>
		<li>Ajouter environ 5 g du liquide d’essai, pesé à 4 décimales (WTL), à un cylindre gradué de 1 L.</li>
		<li>Remplissez le cylindre gradué avec 0,1 M de NaOH jusqu’à un volume final de 1 L.</li>
		<li>Ajouter une barre d’agitation magnétique (p. ex., de 5 à 7 cm de longueur) et remuer rapidement (p. ex., 300 à 400 tr/min) sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que l’échantillon d’essai soit complètement mélangé.</li>
		<li>Transférer le mélange dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 L, évacuer l’espace de tête avec du gaz N2 et couvrir l’ouverture de la fiole avec un couvercle hermétique.</li>
		<li>Placer la fiole d’Erlenmeyer sur une plaque à remuer et mélanger à 300 - 400 tr/min pendant 1 h. REMARQUE: Après ce point, la manipulation des échantillons solides et liquides est la même.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Élimination des matières non solubles des extraits alcalins
<ol><li>À la fin de l’agitation, retirer la fiole de la plaque d’agitation, transférer le mélange dans des tubes centrifuges appropriés et centrifuger tout le volume à 4 921 x g pendant 30 min.</li>
	<li>Recueillir le surnageant alcalin contenant l’HA et le FA dans une fiole propre de 1 L d’Erlenmeyer contenant une barre d’agitation magnétique. Jetez le matériau insoluble. La filtration à travers de la laine de verre ou du papier filtre qualitatif de 2,5 μm de taille poreuse est recommandée si les particules résiduelles ne sont pas précipitées après centrifugation.</li>
</ol>4. Précipitation et séparation de l’AH du FF
<ol><li>Tout en remuant l’extrait alcalin à 300 - 400 tr/min sur une plaque d’agitation, insérez une sonde de pH dans la partie centrale de la solution (verticalement) et ajoutez conc. HCl goutte à goutte à l’extrait alcalin jusqu’à ce qu’un pH stable de pH 1,0 ± 0,1 soit atteint.</li>
	<li>Une fois qu’un pH de pH 1 est atteint et reste stable, retirez la sonde de pH de la fiole, récupérez la barre d’agitation, couvrez la fiole d’un couvercle hermétique et laissez la fiole reposer jusqu’à ce que l’AH précipité se soit déposé au fond de la fiole. REMARQUE: Le temps qu’il faut à une AH pour précipiter et abandonner la solution varie en fonction de la source et de la quantité d’AH dans l’échantillon. Il faut généralement 1 à 6 h pour que l’AH précipite complètement et abandonne la solution.</li>
	<li>Centrifuger l’extrait et précipiter l’AH à 4921 x g pendant 1 h. Après centrifugation, verser le surnageant FF dans un Erlenmeyer propre de 1 L et couvrir avec un couvercle hermétique. REMARQUE: Un temps de centrifugeuse plus long peut être nécessaire afin d’emballer l’AH assez fermement pour permettre la décantation du FF sans inclure aucun des HA précipités.</li>
	<li>Placer les tubes de la centrifugeuse dans un four de séchage maintenu à 100 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Après séchage, retirez les tubes du four de séchage et placez-les dans un dessiccateur pour les refroidir à température ambiante. Après refroidissement, transférez quantitativement le résidu du tube en le grattant sur les côtés et le fond du tube avec une spatule, transférez-le dans un bateau de pesage goudronné et enregistrez la masse (WEHA). Ce résidu est le « HA extrait ». REMARQUE: Si des tubes centrifuges supérieurs à 50 mL ont été utilisés dans la séparation de HA et FF, il est pratique de transférer l’HA précipité dans des tubes centrifuges de 50 mL résistants à la température pour le processus de séchage. De plus, si un lyophilisateur est disponible, l’AH précipité peut être lyophilisé. La collecte de l’AH à l’état lyophilisé est plus facile car l’HA ne colle pas sur le côté des tubes en plastique et n’a pas besoin d’être mis au rebut.</li>
</ol>5. Détermination de la teneur en cendres
REMARQUE: La procédure de détermination de la teneur en cendres des échantillons d’HA et d’AF séchés est la même. La procédure utilisant la notation pour HA est affichée.
<ol><li>Transférer environ 30 mg de HA séché (WHA) dans un plat en céramique (WCD) propre et pré-pesé qui avait été préalablement séché dans un four de séchage à 100 °C, puis refroidi dans un dessiccateur à température ambiante. Après avoir enregistré la masse combinée de l’HA pondéré et de la vaisselle (WHA+CD), brûlez l’HA dans un four à moufle pendant 2 h à 600°C. REMARQUE: Pour chaque échantillon d’AH, trois répétitions doivent être traitées et la teneur moyenne en cendres doit être utilisée dans le calcul de l’AH pure.</li>
	<li>Après 2 h, retirer le plat et le contenu du four à moufle et placer dans un dessiccateur pour refroidir. Une fois refroidi, peser le plat avec de la cendre (WASH+CD) et calculer le rapport de cendres (Ashrat) en utilisant la formule 1.2 : Formule 1.2 Ashrat = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)</li>
</ol>6. Détermination du pourcentage d’HA extrait purifié
<ol><li>Déterminer la masse finale de l’HA pur (WPHA) en corrigeant la teneur en cendres à l’aide de la formule 1.3 : Formule 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)</li>
</ol>7. Détermination de la concentration (%) d’HA pur dans l’échantillon source d’origine
<ol><li>Déterminer la concentration d’HA pur à l’aide des formules 1.4 et 1.5 : Formule 1.4: % d’HA pur dans un échantillon solide = (WPHA/Wsamp) * 100 Formule 1.5: % d’HA pur dans un échantillon liquide = (WPHA/WTL) * 100</li>
</ol>8. Préparation de la colonne pour la purification HFA
<ol><li>Préparez une colonne de chromatographie à basse pression remplie de résine polyméthacrylate de méthyle DAX-8. Si la résine n’a pas été utilisée auparavant, trempez la résine dans du méthanol pendant 2 h, puis rincez abondamment avec du H2O désionisé jusqu’à ce que tout le méthanol soit retiré.<ol>
<li>Enlevez les petites particules de résine qui flottent sur l’eau à ce moment-là. Si la résine a déjà été utilisée, régénérez-la comme décrit à la rubrique 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois bien rincée, versez la résine dans une colonne de chromatographie sur verre de 5 x 25 cm munie d’un embout avec une fritte de 10 μm pour le support du lit de résine. Laisser 2,5 à 5 cm en haut de la colonne pour une solution sans résine afin de permettre le mélange du FF avant d’entrer dans le lit de résine. Installez la pièce supérieure sur la colonne et pompez le H2O désionisé par le haut de la colonne pour emballer le lit de résine DAX-8 à l’aide d’une pompe péristaltique.</li>
</ol>9. Isolement de HFA
<ol><li>Une fois le lit de résine emballé, chargez le FF sur la colonne à l’aide d’une pompe péristaltique, sous basse pression, via le haut de la colonne. Utilisez un débit de 35 à 40 mL/min. Il est essentiel que le haut de la résine dans la colonne reste recouvert de solution tout au long de la procédure de chargement et de rinçage pour éviter le séchage de la résine et la canalisation de l’extrait à travers le lit de résine.</li>
	<li>Une fois que la fraction fulvique a été complètement chargée sur la résine, lavez la résine avec de l’eau désionisée, pour éliminer la « fraction fulvique hydrophile » non adsorbée (HyFF) en la pompant par le haut de la colonne à l’aide de la pompe péristaltique sous basse pression. Utilisez un débit de 35 à 40 mL/min. Rejeter l’effluent contenant de l’HyFF à moins qu’il ne soit utilisé pour l’analyse.</li>
	<li>Laver la colonne avec du H2O désionisé jusqu’à ce que l’absorbance à 350 nm de l’effluent de la colonne soit égale (p. ex., à moins de 0,015 unité d’absorbance) à celle du H2O désionisé utilisé pour laver la colonne. Utilisez de l’eau désionisée à zéro (c.-à-d. vierge) du spectrophotomètre.</li>
	<li>Désorbez le HFA par élution inverse en pompant 0,1 M de NaOH via le fond de la colonne à l’aide de la pompe péristaltique. Utilisez un débit de 35 à 40 mL/min. Capturer l’effluent de la pompe (le Na-fulvate dans un récipient propre de taille suffisante (par exemple, 2 L d’Erlenmeyer). REMARQUE: La plupart des HFA s’adsorbent tout en haut du lit de résine DAX-8. La désorption par introduction du NaOH de 0,1 M par le bas de la colonne minimise la quantité de NaOH de 0,1 M nécessaire pour désorber complètement le FA.</li>
	<li>Tout le HFA a été désorbé lorsque l’absorbance de l’effluent de la colonne est égale à l’absorbance de 0,1 M NaOH influent à 350 nm. Utilisez 0,1 M NaOH comme blanc spectrophotométrique. Ajouter l’effluent prélevé pour vérifier l’absorbance de la solution d’AF désorbée afin de s’assurer que tout l’AF est capturé.</li>
</ol>10. Dé-ashing HFA par protonation
<ol><li>Passer la solution de Na-fulvate, à plusieurs reprises, par alimentation par gravité, à travers une résine échangeuse H+ de cations forts (Table des matériaux) contenue dans une colonne de 5 × 50 cm, avec de la fritte de verre pour retenir la résine, jusqu’à ce que la conductivité électrique de l’effluent soit <120 μS / cm, mesurée avec un conductimètre électrique. Avant chaque passage, la résine échangeuse H+ nécessite une remise à neuf comme décrit à la section 11.<ol>
<li>Pour vous assurer que tout le FA est retiré de la résine après le passage final, lavez la résine avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que l’absorbance de l’effluent à 350 nm soit la même (p. ex., dans les 0,015 unité d’absorbance) que l’eau désionisée utilisée pour laver la colonne. Utilisez du H2O désionisé comme blanc spectrophotométrique. Ajouter le lavage et toutes les portions d’effluents prises pour vérifier l’absorbance de la solution d’AF purifiée. Pour aider à éliminer tout LE FA, la résine peut être agitée (par exemple, à l’aide d’une longue tige de verre ou de plastique) plusieurs fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Concentrer le FA sur un volume d’environ 15 ± 2 mL à l’aide d’un évaporateur rotatif à 55 °C.</li>
	<li>Transférer complètement le concentré de FA de 15 mL dans un tube de centrifugeuse en plastique de 50 mL et sécher à 60±3 °C à séchage constant dans un four de séchage. La lyophilisation est une alternative au séchage au four. Après séchage, transférer le tube dans un dessiccateur pour refroidir.<ol>
<li>Retirez le FA du tube en grattant les côtés et le fond du tube avec une spatule et pesez le FA collecté sur du papier de pesage pré-taré. Ce matériau est le « FA extrait » (WEFA).</li>
		<li>Déterminer le rapport de cendres (ASHrat) de l’AF extrait comme décrit à l’étape 6 pour l’AH et calculer le rapport de cendres à l’aide de la formule 1.2. Déterminer le poids de l’AF extrait sans cendres (WPFA) à l’aide de la formule 1.3, en remplaçant le WEFA par le poids de WEHA. Enfin, déterminez le % de FA pur dans l’échantillon à l’aide de la formule 1.4 remplaçant WPFA par WPHA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. Régénération de la résine DAX-8
<ol><li>Régénérer la résine DAX-8 en pompant 0,1 M HCl (8,33 mL de HCl concentré/1000 mL de volume final désionisé H2O) à un débit de 35 à 40 mL/min à travers le fond de la colonne jusqu’à ce que le pH de l’effluent soit égal au pH de l’influent. Utilisez la pompe péristaltique pour pomper tous les réactifs à travers la colonne DAX-8 pendant la régénération.</li>
	<li>Rincez la colonne avec de l’eau DI en la pompant dans le haut de la colonne jusqu’à ce que le pH de l’effluent soit égal au pH de l’influent (c.-à-d. eau DI).</li>
</ol>12. Régénération de la résine échangeuse de CIV
<ol><li>Régénérez la résine échangeuse de cations H+ dans un processus par lots en versant la résine dans un grand bécher (par exemple, un bécher en plastique de 4 L), rincez plusieurs fois en recouvrant la résine de DI H2O, en mélangeant puis en versant de l’eau.</li>
	<li>Couvrir la résine avec 1 M HCl (83,3 mL de HCl concentré/1000 mL de volume final d’eau DI). Laisser reposer pendant au moins 2 h en remuant occasionnellement (par exemple, une fois toutes les 30 minutes).</li>
	<li>Retirez l’excès d’acide de la résine en versant l’acide et en recouvrant la résine d’eau DI. Remuer vigoureusement avec une tige d’agitation pendant 15 s, puis laisser tomber la résine au fond de la fiole, puis verser l’eau. Répétez le processus jusqu’à ce que la conductivité électrique de l’eau de rinçage soit ≤ 0,7 μS/cm.</li>
	<li>Chargez la résine régénérée dans la colonne. Couvrir avec du H2O désionisé pour s’assurer que la résine reste humide entre les utilisations.</li>
</ol>

<ol>
	<li>DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+origin+and+formation+for+molecular+components+of+humic+acids+in+soils.">Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).</li><li>Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+black+carbon-like+and+alicyclic+aliphatic+compounds+by+hydroxyl+radical+initiated+degradation+of+lignin.">Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin.</a> Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).</li><li>Baldock, J. A., Skjemstad, J. 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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les premières étapes de l’extraction et de l’isolement de l’AH dans cette méthode sont relativement simples. Parce que l’isolement du HFA implique la chromatographie sur colonne, l’obtention de résultats reproductibles s’accompagne d’un strict respect des détails de chaque étape et pratique. En particulier, une préparation correcte des résines est d’une importance primordiale. Il est extrêmement important que la résine polyméthacrylate de méthyle DAX-8 soit préparée et emballée correctement. L’emballage correct de la résine affecte à la fois le rendement et la qualité du HFA. S’il existe une canalisation, alors ni le prétraitement (c’est-à-dire l’acidification) ni l’adsorption de hFA ne seront complets, et la séparation conduira à des résultats inexacts. Si des canaux ou des espaces dans la résine sont observés avant le chargement de l’échantillon, la colonne doit être retirée et agitée pour redistribuer les billes de résine, en les laissant se déposer sans canaux, puis réemballée en pompant du DI H2O propre à travers la résine. De plus, comme mentionné dans le protocole, le maintien d’un volume de liquide au-dessus de la résine lors du chargement du FF sur la résine permettra au FF de se mélanger avant d’entrer dans la résine et entraînera une adsorption plus efficace. Pour la résine forte échangeuse de cations H+ (Table des matériaux), la régénération complète ne peut pas être précipitée. L’échange Na+/H+ prend du temps et il est donc préférable de le faire dans un traitement en vrac afin que la résine puisse être mélangée tout en étant réacidifiée. Mélanger la résine lors du rinçage avec DI H2O aide à éliminer l’excès de HCl. Lors de la montée de la résine acidifiée pour éliminer l’excès d’acide, le mélange de la résine aide à éliminer le HCl. Il est extrêmement important d’éliminer l’acide au point où une conductivité électrique de ≤ 0,7 μS/cm est atteinte. Si ce n’est pas le cas, le HCl sera transféré avec le HFA.
Enfin, lors de la désorption du HFA de la résine DAX-8, une fois que l’absorbance de l’influent est égale à l’absorbance de l’effluent, il est recommandé de laisser la colonne reposer pendant quelques heures pour voir si un HFA supplémentaire sera libéré. Si c’est le cas, cela sera vu comme un jaunissement du liquide au-dessus de la résine. Si cela se produit, l’HFA supplémentaire peut être éliminé par désorption continue jusqu’à ce que les absorbances d’influent/effluent soient à nouveau égales.
L’un des inconvénients de l’isolation HFA est que l’ensemble du processus prend du temps. La désorption complète du HFA de la résine DAX-8 et l’élimination complète de la résine échangeuse H+ entraînent tous deux un volume important de HFA qui doit être réduit par évaporation rotative. C’est certainement un goulot d’étranglement dans l’analyse. Dans le but de réduire ce temps, il a été suggéré de désorber le HFA de la résine DAX-8 en utilisant de l’acétone plutôt que 0,1 M de NaOH14. Les auteurs ont affirmé qu’en utilisant 50% d’acétone comme désorbant à la place du NaOH, un résultat HFA similaire a été obtenu et le DAX-8 a été correctement régénéré et donc l’étape d’échange H + a pu être éliminée. Cette modification a entraîné une réduction considérable du temps d’analyse en raison de la diminution du volume produit et de l’évaporation rotative plus rapide de l’acétone par rapport à l’eau. Cette modification justifie une étude plus approfondie.
Cette méthode se limite à l’analyse de la matière organique qui a subi le processus d’humification et, pour le cas de la tourbe et des charbons tendres, aux autres processus de tourbation et à la tourtification et à la coalification, respectivement. L’humification est le processus par lequel le matériel mort, principalement végétal, est décomposé par une séquence de microbes qui consomment et modifient des substrats de plus en plus récalcitrants. Les processus abiotiques participent également aux réactions de décomposition et de resynthèse. L’humification aboutit finalement à la production de matériaux relativement récalcitrants comprenant des mélanges hétérogènes de milliers de molécules qui forment une gamme de poids moléculaire et de teneurs en carbone, en oxygène et en hydrogène qui forment HS. Les SH sont encore modifiés par touratification et coalification. Par conséquent, cette méthode n’est pas appropriée pour les matières végétales qui ont été modifiées par des procédés chimiques. Par exemple, le lignosulfonate est largement utilisé comme adultérant HFA. Le lignosulfonate est un sous-produit du processus de mise en pâte du sulfite. Par conséquent, ce matériau n’a pas été produit par le processus d’humification. En outre, de nombreuses substances se lient à la résine DAX-8. Par exemple, la résine DAX-8 a été utilisée pour adsorber les pesticides de la solution15. De toute évidence, les pesticides ne sont pas du SH. Ainsi, la liaison d’un matériau à la résine DAX-8 ne justifie pas l’affirmation selon laquelle il s’agit d’un HFA. Les conditions préalables sont à la fois la production par humification et la liaison à la résine DAX-8.
Au fur et à mesure que l’on en apprend davantage sur la contribution des différents composants du SH dans différentes applications, il peut devenir avantageux de fractionner davantage le SH et de modifier ainsi la méthode en conséquence. Telle qu’elle existe, la méthode ne quantifie pas l’HYFA. Cependant, cette fraction peut également avoir une activité, par exemple dans la biostimulation végétale, où l’ensemble du FF est généralement appliqué dans des traitements agricoles plutôt que dans du HFA purifié.

Les substances humiques (SH) sont des résidus dynamiques qui résultent de la décomposition microbienne et de la transformation des tissus végétaux morts1,2,3 augmentés de sous-produits microbiens et de biomasse3,4,5 par un processus appelé humification6. Les SH sont présents dans les sols, les eaux naturelles, les sédiments lacustres, les tourbes, les charbons tendres et les schistes humiques et représentent environ 25 % du carbone organique total sur la terre7. Ces substances sont des mélanges complexes de milliers de molécules uniques qui sont fractionnées en trois fractions principales en fonction de leurs différentes solubilités dans des solutions aqueuses fortement basiques et acides. Ces fractions sont des acides humiques (AH), qui comprennent la fraction soluble dans les alcalis mais insoluble dans les acides; acides fulviques (AF), la fraction soluble dans les alcalis et les acides; et la fraction humine, qui est insoluble à toutes les valeurs de pH6,8. La fraction fulvique (FF) est subdivisée en fractions hydrophobes FA (HFA) et hydrophiles (HyFA). Ces fractions sont définies comme la partie du FF qui se lie à une résine hydrophobe DAX-8 (HFA) et la partie qui ne se lie pas à la résine (HyFA).
Les SH sont de plus en plus utilisés dans l’agriculture, où ils sont largement utilisés comme biostimulants des cultures, dans l’élevage, en particulier comme additif pour l’alimentation du bétail, dans l’exploitation minière dans les boues de forage et dans l’assainissement de l’environnement comme navettes d’électrons. La recherche sur l’utilisation du SH dans les applications médicales humaines est également en augmentation.
Il existe de nombreuses méthodes de quantification de l’AH et de l’AF. Cependant, la plupart de ces méthodes ne sont ni exactes ni précises. Par exemple, les deux méthodes les plus largement utilisées pour la détermination de l’AH aux États-Unis sont la méthode colorimétrique9 et la méthode du California Department of Food and Agriculture (CDFA), qui ont toutes deux surestimé la quantité d’AH dans une gamme de minerais et d’extraits de sources de l’ouest des États-Unis et du Canada10. La méthode colorimétrique ou spectrophotométrique est imprécise car elle repose sur l’absorbance d’extraits alcalins qui comprennent, en plus de l’AH, de l’AF et d’autres chromophores qui absorbent tous à la longueur d’onde utilisée et la norme n’est pas représentative des matériaux testés10. La méthode CDFA n’est pas précise parce qu’elle ne fournit pas de concentrations d’AH sans cendres. Étant donné que différents minerais contiennent différentes quantités de cendres, dont une partie est transportée avec l’extraction et que le processus d’extraction lui-même ajoute des cendres, cette méthode ne fournit pas une valeur précise pour les concentrations d’AH10. En réponse au besoin d’une méthode exacte et précise, une procédure gravimétrique normalisée basée sur celle détaillée par11 a été publiée en 2014 pour traiter de la quantification de l’AH et de l’AF sur une base exempte de cendres12. Cette méthode a ensuite été adaptée, avec des modifications mineures, par l’Organisation internationale de normalisation (ISO) en 2018 sous la rubrique Engrais et conditionneurs de sol sous le titre « Détermination des concentrations d’acides fulviques humiques et hydrophobes dans les engrais »13.
Cet article décrit le protocole d’extraction et de quantification des acides fulviques humiques et hydrophobes et donne des détails sur l’exactitude et la précision des données produites à partir de la méthode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">Amberlite IR 120 H+-exchange resin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10322</td>
			<td style="width:167px;">H+ form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:121px;">Ohaus</td>
			<td style="width:161px;">PA214</td>
			<td style="width:167px;">w/ glass draft shield</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">Allegra X-14</td>
			<td style="width:167px;">minimum 4300 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">To fit rotor selected</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceramic Combustion Crucibles</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">Z247103</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chromatography column for DAX-8</td>
			<td style="width:121px;">Diba</td>
			<td style="width:161px;">Omnifit 006EZ-50-25-FF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chromatography column for IR 120</td>
			<td style="width:121px;">Chemglass</td>
			<td style="width:161px;">CG-1187-21 2 in. by 24 in.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dessicator</td>
			<td style="width:121px;">Capitol Scientic</td>
			<td style="width:161px;">Kimax 21200-250</td>
			<td style="width:167px;">Vacuum type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drying Oven</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Isotemp</td>
			<td style="width:167px;">Precision&#177;3&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrical conductivity meter</td>
			<td style="width:121px;">HM Digital</td>
			<td style="width:161px;">EC-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:121px;">Amazon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">1L, 2L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl concentrated</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">320331</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic Stir Plate</td>
			<td style="width:121px;">Barnstead-Thermolyne</td>
			<td style="width:161px;">Dataplate 721</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic Stir bars</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">These can be obtained at many outlets</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Muffle Furnace</td>
			<td style="width:121px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:161px;">Thermolyne Type 47900</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">795429</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:121px;">Praxair</td>
			<td style="width:161px;">UNI1066</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:121px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:161px;">Masterflex 7518-00</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perstaltic tubing</td>
			<td style="width:121px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:161px;">Masterflex Pharmed 06508-17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pH meter</td>
			<td style="width:121px;">Oakton Instruments</td>
			<td style="width:161px;">WD-35618--03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:121px;">Buchi</td>
			<td style="width:161px;">R-210/R-215</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">Healthcare SCiences</td>
			<td style="width:161px;">Ultrospec II</td>
			<td style="width:167px;">Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of &#177;1 nm and reproducibility of &#177;0.5 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of humic and fulvic acids in humate ores, doc, humified materials and humic substance-containing commercial products

Le but de cette méthode est de fournir une concentration exacte et précise d’acides humiques (HA) et/ou fulviques (AF) dans les charbons tendres, les minerais humiques et les schistes, les tourbes, les composts et les produits commerciaux contenant des substances humiques. La méthode est basée sur l’extraction alcaline de matériaux d’essai, en utilisant 0,1 N NaOH comme extracteur, et la séparation des substances humiques solubles alcalines (HS) des produits non solubles par centrifugation. Le pH de l’extrait alcalin centrifugé est ensuite ajusté à pH 1 avec conc. HCl, ce qui entraîne une précipitation de l’HA. Les HA précipités sont séparés de la fraction fulvique (FF) (la fraction de SH qui reste en solution) par centrifugation. L’AH est ensuite cuit au four ou lyophilisé et la teneur en cendres de l’HA séché est déterminée. Le poids de l’HA pur (c’est-à-dire sans cendres) est ensuite divisé par le poids de l’échantillon et la fraction résultante multipliée par 100 pour déterminer le % d’HA dans l’échantillon. Pour déterminer la teneur en FA, le FF est chargé sur une résine hydrophobe DAX-8, qui adsorbe la fraction FA également appelée acide fulvique hydrophobe (HFA). La fraction d’acide non fulvique restante, également appelée fraction fulvique hydrophile (HyFF), est ensuite éliminée en lavant la résine avec du H2O désionisé jusqu’à ce que tout le matériau non absorbé soit complètement éliminé. Le FA est ensuite désorbé avec 0,1 N NaOH. Le Na-fulvate résultant est ensuite protoné en le faisant passer sur une résine forte échange H+. L’AF résultant est cuit au four ou lyophilisé, la teneur en cendres déterminée et la concentration dans l’échantillon calculée comme décrit ci-dessus pour l’AH.

Les données sur le rendement de la méthode sont présentées dans les tableaux 1 à 5. La précision de la méthode d’extraction de l’AH et de l’AFH à partir d’échantillons commerciaux liquides avec des concentrations très différentes d’HA et de FHA est donnée dans le tableau 1.
Les écarts-types relatifs (DSR) pour l’AH étaient inférieurs à ceux de l’HFA, mais le RSD moyen du HFA sur les trois échantillons liquides était de 6,83 %, ce qui indique un degré élevé de précision. Le rapport de Horwitz (HorRat) est un paramètre de performance normalisé qui indique la pertinence d’une méthode d’analyse en ce qui concerne la précision en laboratoire. Ici, il a été utilisé pour la précision intra-laboratoire. La valeur < 0,5 peut indiquer une moyenne non divulguée ou un niveau élevé d’expérience avec la méthode. Les valeurs > 2.0 indiquent l’hétérogénéité des échantillons d’essai, la nécessité d’une optimisation de la méthode ou d’une formation plus approfondie, fonctionnant en dessous de la limite de détection ou d’une méthode inapplicable. Pour l’analyse d’échantillons liquides, le HorRat n’a été > 2 que pour l’une des analyses HFA (tableau 1).
Les données de précision pour l’extraction de l’AH et du HFA à partir de trois échantillons de minerai humique sont données dans le tableau 2. Encore une fois, à l’exception du HFA extrait de Ore 2 et du HA de Ore 3, tous les HorRat étaient inférieurs à 2. Cela démontre un haut degré de précision de cette méthode pour l’extraction de HA et HFA pour des échantillons de minerai humique.
Les fabricants de biostimulants végétaux formulent souvent des produits qui contiennent du SH en plus d’autres ingrédients comme les algues, les engrais inorganiques, les charbons ou la mélasse. Le tableau 3 donne les résultats d’une analyse de l’inclusion de ces types d’additifs sur la précision de la méthode. Aucun des additifs n’a affecté de manière significative la récupération de l’HA ou de l’HFA (tableau 3).
Les tableaux 4 et 5 font état des récupérations d’HA et de HFA, respectivement, à partir d’échantillons liquides qui simulaient des produits commerciaux à de très faibles concentrations. Les recouvrements ont été excellents et variaient entre 88 % et 97 % pour l’AH (tableau 4) et entre 92 % et 104 % pour l’HFA (tableau 5). Les recouvrements moyens pour l’AH et l’HFA étaient de 93 % et 97 %, respectivement, et le % de RSD pour les deux SH était inférieur à 5 %. Bien que la précision soit excellente, ces données indiquent la nécessité d’effectuer des répliques en laboratoire. La limite de détection de la méthode (LDM) et la limite de quantification de la méthode étaient de 4,62 et 1,47 mg/L pour l’AH et de 4,8 et 1,53 mg/L pour l’HFA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="8">Substances humiques, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matériel</td>
			<td colspan="2">L16</td>
			<td colspan="2">L17</td>
			<td colspan="3">L2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 1</td>
			<td>1.44</td>
			<td>17</td>
			<td>6.59</td>
			<td>7.76</td>
			<td>0.36</td>
			<td colspan="2">4.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 2</td>
			<td>1.39</td>
			<td>16.03</td>
			<td>6.25</td>
			<td>7.79</td>
			<td>0.42</td>
			<td colspan="2">4.93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 3</td>
			<td>1.34</td>
			<td>16.44</td>
			<td>6.02</td>
			<td>7.55</td>
			<td>0.4</td>
			<td colspan="2">4.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 4</td>
			<td>1.54</td>
			<td>16.75</td>
			<td>6.2</td>
			<td>7.69</td>
			<td>0.33</td>
			<td colspan="2">4.53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méchant</td>
			<td>1.43</td>
			<td>16.56</td>
			<td>6.27</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0.38</td>
			<td colspan="2">4.6</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">SD</td>
			<td rowspan="2">0.09</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
			<td>0</td>
			<td rowspan="2">0.11</td>
			<td rowspan="2">0.04</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">0.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>DSR, %</td>
			<td>6.29</td>
			<td>2.53</td>
			<td>3.8</td>
			<td>1.39</td>
			<td>10.4</td>
			<td colspan="2">4.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hor Rat(r)</td>
			<td>1.58</td>
			<td>0.72</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.47</td>
			<td>2.31</td>
			<td colspan="2">1.55</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">
un Les conditions d’extraction étaient de 1 g dans 1 L 0,1 M NaOH.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Précision de la méthode d’extraction et de quantification de l’AH et du HFA à partir d’échantillons commerciaux liquides. Les conditions d’extraction étaient de 1 g dans 1 L 0,1 M NaOH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Substances humiques, %</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Minerai 1</td>
			<td colspan="2">Minerai 2</td>
			<td colspan="2">Minerai 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matériel</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
			<td>HFA</td>
			<td>HA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>67.4</td>
			<td>1.31</td>
			<td>27.01</td>
			<td>1.55</td>
			<td>8.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 2</td>
			<td>1.69</td>
			<td>67.63</td>
			<td>1.25</td>
			<td>27.48</td>
			<td>1.41</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 3</td>
			<td>1.63</td>
			<td>67.1</td>
			<td>1.27</td>
			<td>27.34</td>
			<td>1.47</td>
			<td>8.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Représentant 4</td>
			<td>1.77</td>
			<td>67.59</td>
			<td>1.55</td>
			<td>26.89</td>
			<td>1.51</td>
			<td>7.98</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méchant</td>
			<td>1.71</td>
			<td>67.53</td>
			<td>1.35</td>
			<td>27.18</td>
			<td>1.49</td>
			<td>8.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.14</td>
			<td>0.28</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>DSR, %</td>
			<td>3.7</td>
			<td>1.39</td>
			<td>10.33</td>
			<td>1.02</td>
			<td>4.02</td>
			<td>9.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>HorRat(r)</td>
			<td>0.99</td>
			<td>0.66</td>
			<td>2.71</td>
			<td>0.42</td>
			<td>1.07</td>
			<td>3.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2. Précision de la méthode d’extraction et de quantification de l’AH et du HFA à partir de minerais humiques. Les conditions d’extraction étaient de 1 g d’échantillon dans 1 L 0,1 M NaOH. (Données tirées de Lamar et al., 2014)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Répliquer</td>
			<td>Adultérant</td>
			<td>HA, %</td>
			<td>FA, %</td>
			<td>Récupération relative HA, %</td>
			<td>Récupération relative HFA, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Aucun</td>
			<td>81.61</td>
			<td>12.86</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Aucun</td>
			<td>80.16</td>
			<td>12.78</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Algue</td>
			<td>80.21</td>
			<td>12.85</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Algue</td>
			<td>80.72</td>
			<td>12.79</td>
			<td>99.5</td>
			<td>99.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Engrais</td>
			<td>80.25</td>
			<td>12.98</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Engrais</td>
			<td>79.57</td>
			<td>123.77</td>
			<td>98.8</td>
			<td>101.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Charbon</td>
			<td>78.79</td>
			<td>12.92</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Charbon</td>
			<td>81.27</td>
			<td>12.84</td>
			<td>98.9</td>
			<td>101.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Mélasse</td>
			<td>79.38</td>
			<td>12.99</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Mélasse</td>
			<td>81.02</td>
			<td>12.72</td>
			<td>99.2</td>
			<td>100.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méchant</td>
			<td></td>
			<td>80.3</td>
			<td>12.85</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>0.885</td>
			<td>0.09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
une concentration finale de FA + HA de 2,5 g/L ajoutée à 0,1 M NaOH. (données tirées de Lamar et coll., 2015)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3. Effet des adultérants sur la quantification de l’AH et de l’HFA à partir d’une léonardite de Gascoyne. (Données tirées de Lamar et al., 2015)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">HA</td>
		</tr>
<tr>
<td>EXEMPLE D’ID</td>
			<td>Extrait, mg</td>
			<td>Récupéré, mg</td>
			<td>Récupérés, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>24.6</td>
			<td>23.7</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>22.6</td>
			<td>19.9</td>
			<td>88.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.2</td>
			<td>23.6</td>
			<td>93.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>22.5</td>
			<td>21.5</td>
			<td>95.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>23.9</td>
			<td>21.8</td>
			<td>91.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>23.2</td>
			<td>20.8</td>
			<td>89.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>24</td>
			<td>23.2</td>
			<td>96.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méchant</td>
			<td>23.7</td>
			<td>22.1</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>1.01</td>
			<td>1.52</td>
			<td>3.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>DSR, %</td>
			<td>4.35</td>
			<td>6.88</td>
			<td>3.67</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">(données tirées de Lamar et coll., 2014)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4. Récupération de l’AH à partir d’ébauches enrichies. (Données tirées de Lamar et al., 2014)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">FA</td>
		</tr>
<tr>
<td>EXEMPLE D’ID</td>
			<td>Extrait, mg</td>
			<td>Récupéré, mg</td>
			<td>Récupérés, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19.9</td>
			<td>19</td>
			<td>95.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>23.1</td>
			<td>22.9</td>
			<td>99.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>20.7</td>
			<td>19.4</td>
			<td>93.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20.5</td>
			<td>19.8</td>
			<td>96.39</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>21.6</td>
			<td>103.85</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>21.9</td>
			<td>20.1</td>
			<td>91.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>22.7</td>
			<td>22.3</td>
			<td>98.24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méchant</td>
			<td>21.37</td>
			<td>20.73</td>
			<td>96.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>1.21</td>
			<td>1.53</td>
			<td>3.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>DSR, %</td>
			<td>5.64</td>
			<td>7.36</td>
			<td>4.07</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">(Données tirées de Lamar et al., 2014)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5. Récupération de HFA à partir d’ébauches pointues. (Données tirées de Lamar et al., 2014)

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Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products

Cette méthode permet de quantifier gravimétriquement les substances humiques (p. ex. les acides humique et fulvique) sans cendres, dans les matières sèches et liquides provenant de charbons mous (c.-à-d. lignite oxydé et non oxydé et charbon sous-bitumineux), de minerais d’humate et de schistes, de tourbes, de composts et d’engrais commerciaux et d’amendements du sol.

Quantification des acides humique et fulvique dans les minerais humates, le DOC, les matériaux humifiés et les produits commerciaux contenant des substances humiques

The purpose of this method is to provide an accurate and precise concentration of humic (HA) and/or fulvic acids (FA) in soft coals, humic ores and ...

La nouvelle méthode standard de quantification des acides humiques fournit une analyse plus précise et plus précise par rapport aux méthodes existantes acceptées par le régulateur, et fournit également une méthode standard pour la quantification de l’acide fulvique hydrophobe pur. L’avantage de ce protocole est qu’il fournit une analyse gravimétrique des concentrations d’acide fulvique humique et hydrophobe sur une base sans cendres, et le processus d’extraction a été optimisé pour obtenir les récupérations les plus élevées des acides humique et fulvique à partir d’échantillons. Ryan Fountain, un chimiste analytique de notre laboratoire de chimie humique, fera la démonstration de la procédure.Pour préparer un échantillon solide, utilisez un mortier et un pilon pour écraser environ cinq grammes de l’échantillon à analyser jusqu’à ce que 100% de l’échantillon bien mélangé puisse passer à travers un tamis standard américain, numéro de maillage 200. Pour déterminer gravimétriquement la teneur en humidité de la poudre, transférez environ deux grammes de l’échantillon de poudre dans un bateau de pesage en aluminium prépondéré et enregistrez la masse du bateau et de l’échantillon. Ensuite, placez le bateau de pesée dans un four de séchage à 102 degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, placez le bateau dans un dessiccateur pour refroidir pendant au moins une heure avant de peser et d’enregistrer la masse du bateau de pesée et de l’échantillon séché, puis utilisez la formule pour déterminer la teneur en humidité indiquée. Pour effectuer une extraction à partir d’un échantillon solide, peser environ 2,5 grammes de l’échantillon restant et enregistrer le poids à quatre décimales. Ensuite, chargez l’échantillon dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre et rincez le bateau de pesée avec de l’eau désionisée pour enlever tout le minerai.Remplissez le bécher à un litre avec de l’hydroxyde de sodium de 0,1 molaire et ajoutez une barre d’agitation magnétique de cinq à sept centimètres pour faciliter une agitation rapide de l’échantillon à 300 à 400 tours par minute sur une plaque à mélanger. Lorsque l’échantillon a été bien mélangé, évacuer l’espace de tête de la fiole avec de l’azote gazeux, puis sceller l’ouverture de la fiole avec un couvercle hermétique et placer la fiole sur une plaque d’agitation pour mélanger à 300 à 400 tours par minute pendant 16 à 18 heures. Pour l’extraction de matières liquides, bien agiter l’échantillon pour s’assurer que le liquide d’essai est mélangé de manière homogène, y compris tout résidu qui pourrait être tombé au fond du récipient.Peser environ cinq grammes du liquide d’essai et enregistrer le poids à quatre décimales. Ensuite, ajoutez le liquide à un cylindre gradué d’un litre et remplissez le cylindre d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire jusqu’à un volume final d’un litre. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour mélanger rapidement l’échantillon, comme démontré jusqu’à ce que l’échantillon d’essai soit complètement mélangé avant de transférer le mélange dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre, puis évacuez l’espace de la tête avec de l’azote gazeux et remuez le contenu de la fiole à 300 400 tours par minute pendant une heure, comme démontré.Pour éliminer les matières non solubles des extraits alcalins, à la fin de l’incubation sous agitation, transférer le mélange dans des tubes centrifuges appropriés et centrifuger tout le volume de l’échantillon à 4 921 x G pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de la centrifugation, recueillir le surnageant alcalin contenant l’acide humique et la fraction fulvique, qui contient l’acide fulvique hydrophobe, dans une fiole d’Erlenmeyer propre d’un litre avec une barre d’agitation magnétique. Pour la précipitation de l’acide humique à partir de la fraction fulvique, tout en remuant l’extrait alcalin recueilli à 300 à 400 tours par minute sur une plaque d’agitation, insérez une sonde de pH dans la partie centrale de la solution et ajoutez l’acide chlorhydrique concentré jusqu’à ce qu’un pH stable de pH 1,0 plus ou moins 0,1 soit atteint.Une fois le pH stable, retirez la sonde et remuez la barre, rincez-les à l’eau désionisée et scellez la fiole avec un couvercle hermétique. Laissez reposer la fiole pendant une à six heures jusqu’à ce que l’acide humique précipité se soit déposé au fond avant de centrifuger l’extrait et de précipiter l’acide humique à 4 921x G pendant une heure. À la fin de la centrifugation, verser les surnageants contenant la fraction fulvique dans une fiole d’Erlenmeyer propre d’un litre et sceller la fiole avec un couvercle hermétique.Placez les tubes de centrifugeuse contenant de l’acide humique dans un four de séchage à 100 degrés Celsius pendant 24 heures et assurez-vous que les couvercles sont desserrés ou retirés pour assurer le séchage. Après séchage, refroidir les tubes dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’ils atteignent la température ambiante. Après refroidissement, utilisez une spatule pour transférer le résidu de chaque tube dans un seul bateau de pesée goudronné afin de déterminer la masse de l’échantillon d’acide humique extrait.Pour déterminer la teneur en cendres dans l’échantillon, transférer environ 30 milligrammes d’acide humique séché dans un plat en céramique propre et pré-pesé pour déterminer la masse de l’échantillon et du plat de pesage. Ensuite, brûlez l’acide humique dans un four à moufle pendant deux heures à 600 degrés Celsius avant de refroidir le plat dans le dessiccateur. Une fois refroidi, pesez le plat et utilisez la formule pour calculer le rapport de cendres.Pour déterminer la masse finale de l’acide humique pur, utilisez la formule pour corriger la teneur en cendres. Ensuite, utilisez les formules pour déterminer la concentration d’acide humique pur. Pour préparer une nouvelle colonne de chromatographie en résine de polyméthacrylate de méthyle DAX8 à basse pression, faites tremper la résine dans le méthanol pendant deux heures dans un bécher avant de rincer soigneusement la résine avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que tout le méthanol soit retiré.Ensuite, retirez toutes les petites particules de résine flottant sur l’eau. Une fois bien rincée, versez la résine rincée ou régénérée dans une colonne de chromatographie sur verre de 5 x 25 centimètres équipée d’un embout avec une fritte de 10 microns pour le support du lit en résine, en laissant 2,5 à 5 centimètres en haut de la colonne et remplacez la pièce supérieure sur la colonne. Pour remettre à neuf une résine déjà utilisée ou préparer une nouvelle résine fraîchement lavée, utilisez la pompe péristaltique pour pomper de l’acide chlorhydrique 0,1 molaire à un débit de 35 à 40 millilitres par le bas de la colonne jusqu’à ce que le pH de l’effluent soit égal au pH de l’influent, puis pompez l’eau désionisée dans le haut de la colonne jusqu’à ce que le pH de l’effluent soit égal au pH de l’influent.Une fois le lit de résine emballé, utilisez une pompe péristaltique pour charger la fraction fulvique sur la colonne sous basse pression via le haut de la colonne à un débit de 35 à 40 millilitres. Une fois que la fraction fulvique a été complètement chargée sur la résine, lavez la résine avec de l’eau désionisée pour éliminer la fraction fulvique hydrophile non adsorbée. Laver la colonne avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que l’absorbance de l’effluent de la colonne à 350 nanomètres soit égale à celle de l’eau désionisée utilisée pour laver la colonne.Pour désorber le HFA, pomper l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire par le fond de la colonne et capturer l’effluent de fulvate de sodium de la pompe dans un récipient propre et de taille suffisante. Tout le HFA a été désorbé lorsque l’absorbance de l’effluent de la colonne est égale à l’absorbance de l’influent d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire à 350 nanomètres. Pour dé-cendres du HFA par protonation, versez d’abord de la résine échangeuse proton/cation dans un grand bécher et couvrez et mélangez la résine avec de l’eau fraîche désionisée plusieurs fois, en versant de l’eau après chaque rinçage jusqu’à ce que la couleur rouge ait été complètement éliminée.Après le dernier lavage, couvrir la résine d’une molaire d’acide chlorhydrique et laisser reposer le mélange pendant au moins deux heures, en remuant toutes les 30 minutes. À la fin du traitement d’acidification, remplacez l’acide par de l’eau désionisée et remuez vigoureusement avec une tige d’agitation pendant 15 secondes avant de laisser tomber la résine au fond de la fiole et de verser l’eau. Répétez le processus jusqu’à ce que la conductivité électrique de l’eau de rinçage soit inférieure ou égale à 0,7 microSiemens par centimètre et chargez la résine régénérée dans une colonne de 5 x 50 centimètres avec une fritte en verre pour retenir la résine.Ensuite, couvrez la résine avec de l’eau fraîche désionisée et passez à plusieurs reprises le fulvate de sodium à travers la résine forte échangée par cation / proton par gravité jusqu’à ce que la conductivité électrique de l’effluent soit inférieure à 120 microSiemens par centimètre. Pour s’assurer que tout le FA est retiré de la résine, après le passage final, lavez la résine avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que l’absorbance de l’effluent à 350 nanomètres soit la même que l’eau désionisée utilisée pour laver la colonne. Ajouter le lavage et tout effluent utilisé pour vérifier l’absorbance à la solution d’AF purifiée.Pour aider à l’élimination du FA, la résine peut être agitée plusieurs fois. Utilisez un évaporateur rotatif à 55 degrés Celsius pour concentrer le FA à un volume d’environ 15 millilitres et transférez complètement tout le volume de concentré de FA dans un tube de centrifugeuse en plastique de 50 millilitres. Sécher l’échantillon à 60 plus ou moins trois degrés Celsius à séchage constant dans le four de séchage et transférer le tube au dessiccateur pour refroidir.Lorsque l’échantillon a refroidi, utilisez une spatule pour gratter l’AF extrait sur un morceau de papier pesé pré-pesé et déterminer le rapport de cendres, le poids de l’AF extrait et le pourcentage d’AF pur dans l’échantillon original, comme démontré pour l’acide humique. Dans ce tableau, les données de précision pour la méthode d’extraction de l’HA et de l’HFA à partir d’échantillons commerciaux liquides avec des concentrations très différentes d’HA et de HFA sont présentées. L’écart-type résiduel pour l’AH était inférieur à celui de l’HFA, mais l’écart-type résiduel moyen de l’HFA sur trois échantillons liquides était de 6,83 %, ce qui indique un degré élevé de précision.Le ratio de Horowitz était également supérieur à deux pour une seule des analyses HFA. Dans ce tableau, les données de précision pour l’extraction de l’AH et du HFA à partir de trois échantillons de minerai humique sont présentées. Semblable à l’analyse précédente, à l’exception du HFA extrait du minerai deux et de l’HA du minerai trois, tous les rapports de Horowitz étaient inférieurs à deux, démontrant le haut degré de précision de cette méthode pour l’extraction de HA et HFA à partir d’échantillons de minerai humique.Dans cette analyse, aucun additif biostimulant végétal n’a été observé pour affecter de manière significative la récupération de l’HA ou de l’HFA. Dans ces tableaux, les récupérations d’HA et de HFA à partir d’échantillons liquides qui ont stimulé les produits commerciaux à très faibles concentrations sont montrées. Les récupérations ont été excellentes, allant de 88% à 97% pour l’AH, et de 92% et 104% pour l’HFA, mais indiquant également la nécessité d’effectuer des réplications en laboratoire.Suite à cette procédure, les acides humique et fulvique secs obtenus peuvent être utilisés à des fins de caractérisation, tels que le carbone 13 et la résonance électronique RMN protonique, et la spectrométrie de masse à ultra-haute résolution, entre autres techniques utiles. Et cela peut être utilisé pour la caractérisation de la chimie de l’humus, ainsi que pour un outil utile pour approfondir la relation structure-activité avec la forme physique de la plante et les mécanismes de défense sous-jacents des plantes.

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