Denne protokol kan bruges til at studere sår-induceret polyploidisering. En bevare væv reparation proces, hvor cellerne vokser i stedet for at opdele i den voksne frugt flue. En simpel punktering sår kan gøres for at fremkalde polyploidi i fluepitel inden for blot to dage.
Epitelcellestørrelse, ploidy og organisation, kan derefter vurderes nemt. Begynd med at samle to hætteglas, der indeholder 10 til 15 nyligt lukkede hundyr bananfluer af stammen af interesse. Og aldring fluerne i friske fødevarer hætteglas, med cirka fem mandlige fluer pr hætteglas ved 25 grader celsius, indtil tre til fem dage gammel.
For abdominal sårede, i slutningen af inkubationen, skal du bruge en enkelt 0,1 millimeter rustfrit stål pin til at samle flere pin indehavere, med den skarpe ende af hver pin pacing ud. Bedøve den gamle kvindelige frugt fluer på en kuldioxid flyve pad under et stereomikroskop. Og brug en pensel til at arrangere fluerne i en række.
Iført sikkerhedsbriller med en stiftholder i den ene hånd og pincet i den anden skal du bruge pinceterne til at placere fluerne med deres ventrale maver opad. Derefter punktere den voksne hun flyver i epitelblå højre region af mål A4 på hver side af ventrale midterlinjen røre nætter og returnere de sårede fluer til mad hætteglasset, indtil det ønskede eksperimentelle tidspunkt efter skade. På det eksperimentelle endepunkt skal du kontrollere, om såret og arret er tilstedeværelsen af såret og arret i hver bedøvet flue under stereomikroskopet, og fyld en brønd af en ni brønddissektionsskål med Graces opløsning.
Ved hjælp af et par saftæt, forstå en såret kvindelig flyve ved rygsøjlen side af brystkassen og nedsænkes i fluen i brønden af opløsning. Med den anden hånd, bruge et andet par kraftafrive til at punktere og fjerne dorsale neglebånd under målet A6, på bagsiden af frugtfluen. Hvis de indre organer ikke ekstraheres, lægge pres på den dorsale side af maven til at presse de resterende organer.
Brug de vicess til at knække hele maven ved brystkassen krydset over målet A2 og overføre maven til et godt, der indeholder ca 100 mikroliter af Grace's opløsning. Når alle mavener er blevet indsamlet, reducere mængden af Grace's opløsning i samlingen godt til 30 mikroliter. Brug hæcener i den ene hånd til at holde mavens rygside ned og bruge den anden hånd til at indsætte den nederste klinge i Venedig foråret saks i bughulen i hver mave og skæres langs rygmens midterlinje, indtil maven er helt åben.
Tilsæt 30 mikroliter af Graces opløsning i hvert monteringsområde på en tør dissekerendeplade med 4,1 millimeter ben pr. abdominal monteringsområde Og læg den fileterede mave i dråben af opløsningen. Når alle maven er blevet fileteret og placeret, pin maven til fadet på de fire dorsale hjørner. Pas på, at vævene ligger fladt uden at rive eller overbelaste mavevævet.
Udskift derefter Graces opløsning med 30 mikroliter en fiksativ opløsning pr. monteringsområde. Og placere et bånd etiket på bunden af hver skål for at markere hver kontrol og eksperimentel gruppe. For at montere fluevævsprøver.
Efter farvning skal du bruge vicesiner til at frigøre maven fra dissekeringpladen under stereomikroskopet. Og brug vices til at overføre hver prøve ved sin dorsale flanke i ca. 30 mikroliter monteringsmedium på individuelle glasdækselssedler. Under stereomikroskopet orientere abdominalvævet, så indersiden vender nedad mod dækslet og bruge krafterne til at trække de orienterede maver til kanten af hver mediedråbe.
Anslå hver monteret dæksel på en mærket glasrutsjebane. Og bruge et laboratorium væv til at fjerne eventuelle overskydende montering medium. Derefter forsegle kanterne af dækslet slip med klar søm polish og gemme dias i slide boksen ved fire grader celsius, indtil deres billeddannelse.
Den septate junction protein hurtigt tre, som etiketter celle cellekryds, giver en indikator for, om eventuelle forarbejdning urolige opstod under præparatet. Maver med store ridser af ubeboet område, der forstyrrer sårområdet, skal kasseres og ikke indgå i analysen. Sårreparationen er færdig, når en central stor flerkernet celle dækker sårsværd.
Huller på over 10 mikrometer på epitelpladen betragtes som defekter ved sårlukning og re-epitelisering. I denne repræsentative analyse ved hjælp af fluer med hæmmet mitotisk celle aktivering, 52% af sårene var ude af stand til at danne en kontinuerlig epitel ark over såret skorpe. Denne membran sårheling essay giver mere information om omfanget af såret reparation defekt tillader re-epithelialisering defekter, der skal grupperes som enten helt åben, delvist lukket eller helt lukket.
For eksempel, i dette eksperiment hæmning af sår induceret polyploidisering ved samtidig blokering af endo replikation og celle fusion, forårsaget på 92% af epitelsår til at forblive helt åben. Mens aktivering af mitotiske celle cyklus resulterede i en epitel sår lukning defekt. Desuden blev cellecyklusaktiviteten påvist ved inkorporering af thymidinanalogen EDU, og epitel ploidy blev bestemt ved direkte at måle det nukleare DNA-indhold.
Når dissekere ud abdominal epitel, passe på ikke at røre vævet med nogen af de disecting værktøjer, da dette vil ridse prøven. Efter dissektion, celle spredning, celledød, celletab snit størrelse eller nukleare DNA-indhold vurderinger kan udføres for bedre at forstå sårinduceret polyploidisering. eller andre processer i epitel.