Name: rapid and cost-effective rna extraction of rat pancreatic tissue
Uploaded: 2020-09-19T14:00:00
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Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dalla Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. Ringraziamo il Sig. Eomorodian e il Sig. Rostami presso il Dipartimento di e-Learning in Scienze Mediche, Scuola Virtuale e Centro di Eccellenza in e-Learning, Università di Scienze Mediche di Shiraz per la modifica del video.

L'approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dalla Shiraz University of Medical Sciences (numero di approvazione: 93-01-01-7178-03-07-2014).
NOTA: Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250 g. Posizionare la fiala contenente una scheggia di tessuto pancreatico immerso nel reagente stabilizzante dell'RNA in un serbatoio di azoto liquido a -80 gradi centigradi e utilizzare la soluzione del reagente di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dell'R...

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Nella biologia molecolare è fondamentale ottenere RNA di alta qualità. La presenza degli enzimi ribonucleasi nelle cellule e nei tessuti degrada rapidamente l'RNA e rende l'estrazione complessa. Le rule sono enzimi stabili che funzionano senza co-fattori. Piccole quantità di RNase sono adeguate per distruggere l'RNA. Quando il tessuto pancreatico del ratto viene rimosso dalla cavità addominale, è necessario disinfettare gli strumenti chirurgici con detergenti forti, sciacquarli accuratamente e metterli in forno per ...

I dati genetici strutturali possono essere trascritti in un prodotto funzionale attraverso l'espressione genica. L'analisi dell'RNA viene utilizzata per scoprire le differenze nell'espressione genica in diverse condizioni. Ci sono una serie di metodi per estrarre gli acidi nucleici come segue: guanidinium thiocyanate, estrazione tramite fenolo-cloroformio, cromatografia a base di cellulosa, estrazione da matrici di silice e scambio dianioni 1,2.
La corretta rilevazione dell'espressione genica è influenzata dall'integrità dell'RNA isolato dai tessuti; pertanto, è fondamentale valutare l'integrità dell'RNA isolato dai tessuti prima che vengono effettuati ulteriori test perché test molecolari complementari su RNA di bassa qualità possono compromettere i risultati dell'applicazione diagnostica. Pertanto, l'RNA ad alta integrità è necessario per i test biologici molecolari con diverse applicazioni diagnostiche: RT-PCR quantitativo, micro-array, analisi della protezione della ribonucleasi, analisi delle macchie settentrionali, mappatura dell'RNA e costruzione della libreria cDNA3,4.
L'RNA diventa piuttosto instabile dopo essere stato tenuto a lungo. Frammenti di mRNA lunghi oltre 10 kb sono particolarmente suscettibili alla degradazione5,6. Pertanto, i ricercatori devono considerare vari fattori che influenzano l'integrità dell'RNA purificato. La purezza dell'RNA deve essere protetta da RNases, proteine, DNA genomico e contaminazione da inibitori enzimatici. Inoltre, il miglior e accettabile rapporto di assorbimento tra RNA e UV (260/280) deve essere compreso nell'intervallo di 1,8-2,0 con frammentazione minima sull'elettroforesi. Tecniche di laboratorio sviluppate di recente hanno permesso agli scienziati di valutare l'integrità del campione di analisi molecolarepiù praticamente 7,8.
È molto più difficile estrarre l'RNA non danneggiato dal tessuto pancreatico rispetto ad altri tipi di tessuti a causa dell'elevata quantità di ribonucleasi (RNases). Tuttavia, i metodi di estrazione esistenti, vale a dire la rapida espulsione del tessuto pancreatico dalla cavità addominale e l'omogeneizzazione a basse temperature per ostacolare le RNases, si sono dimostrati inefficaci7,8,9,10,11,12,13,14.
Lo scopo dell'attuale studio sperimentale comparativo è quello di modificare e confrontare i metodi esistenti per determinare i metodi più efficienti. A tal fine, vari protocolli di estrazione dell'RNA sono stati modificati e confrontati. Era specificamente finalizzato a determinare il metodo meno costoso che richiede una quantità minima di tessuto pancreatico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>116801</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atoclave</td>
			<td>Teb Zaim</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107024</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis tank</td>
			<td>Payapajoohesh</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microTube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>sigma</td>
			<td>E 8751</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>81870</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>344198</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>344206</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer-sunicator</td>
			<td>Microson XL 2000</td>
			<td></td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>sigma</td>
			<td>19516</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1867-66-9</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Jal Tajhiz</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mgnetic stirrer</td>
			<td>Labrotechnik</td>
			<td></td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Extragene</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>sigma</td>
			<td>85022106</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na AC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567422</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109137</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Teb Zaim</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Later/RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instrument</td>
			<td>Agn Thos</td>
			<td></td>
			<td>German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>AvaPezeshk</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriPure reagent/RNA extraction reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11667157001</td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>Netherland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zylazine</td>
			<td>sigma</td>
			<td>7361-61-7</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and cost-effective rna extraction of rat pancreatic tissue

Indipendentemente dal metodo di estrazione, l'estrazione ottimizzata dell'RNA dei tessuti e delle linee cellulari viene effettuata in quattro fasi: 1) omogeneizzazione, 2) denaturazione efficace delle proteine da RNA, 3) inattivazione della ribonuclea e 4) rimozione della contaminazione da DNA, proteine e carboidrati. Tuttavia, è molto laborioso mantenere l'integrità dell'RNA quando ci sono alti livelli di RNase nel tessuto. L'autolisi spontanea rende molto difficile estrarre l'RNA dal tessuto pancreatico senza danneggiarlo. Pertanto, è necessario un metodo pratico di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dei tessuti pancreatici durante il processo di estrazione. Uno studio sperimentale e comparativo dei protocolli esistenti è stato effettuato ottenendo 20-30 mg di tessuti pancreatici di ratto in meno di 2 minuti ed estraendo l'RNA. I risultati sono stati valutati per elettroforesi. Gli esperimenti sono stati effettuati tre volte per la generalizzazione dei risultati. Immergere il tessuto pancreatico nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 24 h ha prodotto RNA ad alta integrità, quando il reagente di estrazione dell'RNA è stato utilizzato come reagente. I risultati ottenuti sono stati paragonabili ai risultati ottenuti da kit commerciali con attacchi di colonna di spin.

Valutazione dell'integrità dell'RNA nel reagente di estrazione dell'RNA secondo un protocollo chirurgico di routine e modificato senza reagente di stabilizzazione dell'RNA Dopo l'estrazione dell'RNA sono state osservate bande inaccettabili con il reagente di estrazione dell'RNA da un protocollo chirurgico di routine. La corsia 1 mostra l'RNA dal fegato come controllo. La corsia 2 mostra lo stato degradato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenuto da un protocollo chirurgico di routine. Qua...

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Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

La purezza e l'integrità dell'RNA isolato è un passo vitale nei saggi dipendenti dall'RNA. Qui, presentiamo un metodo pratico, rapido ed economico per estrarre l'RNA da una piccola quantità di tessuto pancreatico non danneggiato.

Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Ciao a tutti. Abbiamo progettato, un metodo descrittivo semplice e rapido in classe per un'efficiente estrazione dell'RNA dal tessuto pancreatico. Il principale vantaggio di questo metodo è una procedura ottimizzata per estrarre l'RNA dalla quantità minima di tessuto a causa dell'autolisi. Ciao di nuovo. La dimostrazione della procedura sarà fatta da Sanaz Dastghaib, che è il mio dottorando nel nostro laboratorio presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Scienze Mediche di Shiraz.Prima prepara il luogo dell'intervento chirurgico, metti tutti i requisiti sotto il cofano. Per inattivare la RNasi sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in forno. Iniettare chetamina-xiloazina intraperitoneale 80/8 milligrammo per chilogrammo. Aggiungere 1 reagente di stabilizzazione cc.RNA in un microtubo adeguato per abitare l'attivazione dell'endonucleasi nei tessuti esistenti. Posizionare immediatamente il topo sulla tavola chirurgica. Allontanati dal chirurgo per un'incisione della linea mediana. Quindi, sterilizzare tutta la superficie addominale con il 70% di alcol per rimuovere i peli del topo. Tagliare la pelle per l'intervento. L'incisione rimodella è stata fatta per aprire l'addome dall'area pubica alle zampe anteriori. Capovolgere gli organi addominali sul lato sinistro, per esporre il pancreas. Trova attentamente il tessuto del pancreas, che si diffonde nella cavità addominale. Individuare l'area esposta per scoprire il pancreas senza essere confusi con il tessuto adiposo. Rimuovere immediatamente il pancreas da 20 a 30 milligrammi dalla cavità addominale in meno di due minuti. Mettere il tessuto rimosso nel microtubo molto rapidamente e tagliarlo con la fresa a cavalco per penetrare nel reagente di stabilizzazione dell'RNA nei tessuti separati. Posizionare il microtubo nel serbatoio dell'azoto per congelare immediatamente. Tutti i loro microtubi devono essere conservati negli 80

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