Name: rapid and cost-effective rna extraction of rat pancreatic tissue
Uploaded: 2020-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue at JoVE.com

O presente estudo foi apoiado financeiramente pela Universidade shiraz de ciências médicas (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Agradecemos ao Sr. Zomorodian e ao Sr. Rostami no Departamento de e-Learning em Ciências Médicas, Escola Virtual e Centro de Excelência em e-Learning, Universidade shiraz de Ciências Médicas por editar o vídeo.

A aprovação ética para este estudo foi obtida pela Universidade de Ciências Médicas de Shiraz (número de aprovação: 93-01-01-7178\03-07-2014).
NOTA: Use ratos machos Sprague-Dawley pesando 250 g. Coloque o frasco contendo uma lasca de tecido pancreático imerso no reagente estabilizador de RNA em um tanque de nitrogênio líquido a -80 °C e use a solução de reagente de extração de RNA para manter a integridade do RNA.
1. Remoção do tec...

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Na biologia molecular é vital obter RNA de alta qualidade. A presença das enzimas ribonuclease em células e tecidos rapidamente degrada o RNA e torna o complexo de extração. RNases são enzimas estáveis funcionando sem quaisquer cofatores. Pequenas quantidades de RNase são adequadas para destruir o RNA. Quando o tecido pancreático de rato é removido da cavidade abdominal, é necessário desinfetar os instrumentos cirúrgicos por detergentes fortes, enxaguar-os completamente e colocá-los em um forno por pelo men...

Dados genéticos estruturais podem ser transcritos para um produto funcional através da expressão genética. A análise de RNA é usada para descobrir diferenças na expressão genética em diferentes condições. Existem uma série de métodos para extrair ácidos nucleicos da seguinte forma: tiocianato de guanidinium, extração via fenol-clorofórmio, cromatografia à base de celulose, extração por matrizes de sílica e troca deânion 1,,2.
A detecção adequada da expressão genética é influenciada pela integridade do RNA isolado dos tecidos; portanto, é vital avaliar a integridade do RNA isolado dos tecidos antes que novos testes sejam realizados, pois testes moleculares complementares em RNA de baixa qualidade podem comprometer os resultados da aplicação diagnóstica. Assim, o RNA de alta integridade é necessário para testes biológicos moleculares com diferentes aplicações diagnósticas: RT-PCR quantitativo, micro arrays, ensaio de proteção à ribonuclease, análise de manchas do norte, mapeamento de RNA e construção de biblioteca cDNA3,,4.
O RNA torna-se bastante instável depois de ser mantido por muito tempo. Fragmentos longos de mRNA acima de 10 kb são particularmente suscetíveis à degradação5,6. Assim, os pesquisadores devem considerar vários fatores que influenciam a integridade do RNA purificado. A pureza do RNA deve ser protegida contra RNases, proteínas, DNA genômico e contaminação inibidora enzimática. Além disso, a melhor e aceitável razão de absorção de RNA para UV (260/280) deve estar dentro da faixa de 1,8-2.0 com fragmentação mínima sobre a eletroforese. Técnicas laboratoriais recentemente desenvolvidas permitiram aos cientistas avaliar a integridade da amostra de análise molecular mais praticamente7,,8.
É muito mais difícil extrair RNA não danificado do tecido pancreático do que outros tipos de tecidos devido à alta quantidade de ribonucleases (RNases). Entretanto, os métodos de extração existentes, ou seja, a rápida ejeção do tecido pancreático da cavidade abdominal e a homogeneização a baixas temperaturas para impedir as RNases, provaram-se ineficazes7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,14.
O objetivo do presente estudo experimental comparativo é modificar e comparar os métodos existentes para determinar os métodos mais eficientes. Para isso, vários protocolos de extração de RNA foram modificados e comparados. O objetivo foi especificamente determinar o método mais barato que exige uma quantidade mínima de tecido pancreático.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>116801</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atoclave</td>
			<td>Teb Zaim</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107024</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis tank</td>
			<td>Payapajoohesh</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microTube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>sigma</td>
			<td>E 8751</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>81870</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>344198</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>344206</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer-sunicator</td>
			<td>Microson XL 2000</td>
			<td></td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>sigma</td>
			<td>19516</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1867-66-9</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Jal Tajhiz</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mgnetic stirrer</td>
			<td>Labrotechnik</td>
			<td></td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Tips</td>
			<td>Extragene</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>sigma</td>
			<td>85022106</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na AC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567422</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109137</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Teb Zaim</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Later/RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instrument</td>
			<td>Agn Thos</td>
			<td></td>
			<td>German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>AvaPezeshk</td>
			<td></td>
			<td>Iran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriPure reagent/RNA extraction reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11667157001</td>
			<td>USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>Netherland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zylazine</td>
			<td>sigma</td>
			<td>7361-61-7</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and cost-effective rna extraction of rat pancreatic tissue

Independentemente do método de extração, a extração otimizada de RNA de tecidos e linhas celulares é realizada em quatro estágios: 1) homogeneização, 2) desnaturação efetiva de proteínas de RNA, 3) inativação de ribonuclease e 4) remoção da contaminação do DNA, proteínas e carboidratos. No entanto, é muito trabalhoso manter a integridade do RNA quando há altos níveis de RNase no tecido. A autolise espontânea torna muito difícil extrair RNA do tecido pancreático sem danificá-lo. Assim, é necessário um método prático de extração de RNA para manter a integridade dos tecidos pancreáticos durante o processo de extração. Um estudo experimental e comparativo dos protocolos existentes foi realizado obtendo 20-30 mg de tecidos pancreáticos de ratos em menos de 2 minutos e extraindo o RNA. Os resultados foram avaliados por eletroforese. Os experimentos foram realizados três vezes para generalização dos resultados. A imersão do tecido pancreático no reagente de estabilização de RNA a -80 °C por 24 h rendeu RNA de alta integridade, quando o reagente de extração de RNA foi usado como reagente. Os resultados obtidos foram comparáveis aos resultados obtidos a partir de kits comerciais com as vinculações da coluna spin.

Avaliação da integridade do RNA no reagente de extração de RNA de acordo com um protocolo cirúrgico de rotina e modificado sem reagente estabilizador de RNA Bandas inaceitáveis foram observadas após a extração do RNA com o reagente de extração de RNA a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. A faixa 1 mostra RNA do fígado como controle. A faixa 2 mostra o estado degradado das bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtido a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. Quando a quantida...

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Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

A pureza e integridade do RNA isolado é um passo vital nos ensaios dependentes do RNA. Aqui, apresentamos um método prático, rápido e barato para extrair RNA de uma pequena quantidade de tecido pancreático não danificado.

Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Olá a todos. Nós projetamos, um método descritivo simples e rápido na classe para a extração eficiente de RNA a partir de tecido pancreático. A principal vantagem deste método é um procedimento otimizado para extrair RNA da quantidade mínima de tecido devido à autolise. Oi de novo. A demonstração do procedimento será feita por Sanaz Dastghaib, que é meu aluno de DOUTORADO em nosso laboratório no Departamento de Bioquímica da Universidade de Ciências Médicas shiraz.Primeiro prepare o local da cirurgia, coloque todos os requisitos sob o capô. Para inativar RNase estérilize todos os instrumentos cirúrgicos em um forno. Injete cetamina-xilazina intraperitoneal 80/8 miligramas por quilograma. Adicione 1 reagente de estabilização cc.RNA no microtubo adequado para habitar a ativação da endonuclease nos tecidos existentes. Coloque imediatamente o rato no quadro cirúrgico. Afaste o cirurgião para uma incisão no meio da linha. Em seguida, esterilize toda a superfície abdominal com 70% de álcool para remover o cabelo de rato. Corte a pele para a cirurgia. A correção remodelou a incisão para abrir o abdômen da área púbica para as pernas dianteiras. Vire os órgãos abdominais para o lado esquerdo, para expor o pâncreas. Encontre cuidadosamente o tecido do pâncreas, que está espalhado na cavidade abdominal. Localize a área em exposição para descobrir o pâncreas sem ser confundido com o tecido adiposo. Remova imediatamente o pâncreas de 20 a 30 miligramas da cavidade abdominal em menos de dois minutos. Coloque o tecido removido no micro tubo muito rapidamente e corte-o com o cortador de astride para penetrar o reagente de estabilização RNA para tecidos separados. Coloque o microtubo no tanque de nitrogênio para congelar imediatamente. Todos os seus microtubos devem ser mantidos no 80

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