Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

نشكر الدكتور أندرو سيكيما وأندريا كامينسكي على قراءتهما النقدية لهذه المخطوطة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني الأمريكي لبرنامج البحوث الصحية الداخلية؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) ZIA ES103247 إلى R.E.S) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR; 146626 إلى M.C.P).

1- الإعداد
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت والكواشف.<ol>
<li>جعل 1x التفاعل العازلة من خلال الجمع بين 20 ميكرولتر من 1 م تريس (درجة مئوية = 8.0)، 40 ميكرولتر من 5 م كلوريد الصوديوم، 2.5 ميكرولتر من 2 م كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكرولتر من 50٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين، والمياه الخالية من RNase للوصول إلى حجم إجمالي قد...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

وصف هو مقايسة لقياس نشاط كيناز من Grc3 PNK على ركائز النيوكليوتيدات الفلورية التي تحمل علامة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف إنزيمات PNK الأخرى عن طريق تكييف العازلة رد الفعل وركيزة القلة. على سبيل المثال، يستدعي البروتوكول كمية من EDTA. إضافة EDTA مفيد لسببين: أولاً، هذا النهج يفضل Grc3 المرتبطة ...

3- تلعب الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNK) أدواراً حاسمة في العديد من مسارات معالجة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ( DNA) ، مثل إصلاح الحمض النووي وتجميع الريبوسوم1،2،3،4،5. هذه الإنزيمات الأساسية تحفز نقل محطة (غاما) أحادي الفوسفات من ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد (NTP، في معظم الأحيان ATP) إلى نهاية الهيدروكسيل 5 'من الركيزة النيوكليوتيد. واحدة من أكثر PNKs تتميز بشكل جيد هو bacteriophage T4 PNK ، التي لديها خصوصية الركيزة العريضة وتستخدم بشكل كبير من قبل مختبرات البيولوجيا الجزيئية لدمج تسميات النظائر المشعة على 5 ذرة من الحمض النووي أو الركيزة RNA6،7،8،9،10،,12.11 مثال آخر من إنزيم PNK هو CLP1، الذي تم العثور عليه في Eukarya، Eubacteria، و Archaea، وتورط في عدة مسارات معالجة الحمض النووي الريبي4،13،14،15.
تاريخيا، معظم المقايسات التي تقيس نشاط كيناز متعدد النوكليوتيد تعتمد على وضع العلامات النظائر المشعة والتصوير الذاتي اللاحق5،16. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدد من المقايسات إضافية لقياس نشاط PNK، بما في ذلك نهج جزيء واحد، electrophoresis رقاقة، منارات الجزيئية، وكذلك colorimetric والإنارة المستندة إلىالمقايسات 17،18،19،20،21،22. وفي حين أن العديد من هذه النهج الجديدة توفر حدوداً معززة للكشف وتتجنب استخدام النشاط الإشعاعي، فإن لكل منها عيوباً، مثل التكلفة والاعتماد على الراتنج غير المُجَدَّد، والقيود المفروضة على اختيار الركيزة.
Grc3 هو كيناز متعدد النوى التي تلعب دورا محوريا في معالجة ما قبل الريبوزوم RNA2,3,23. Grc3 يشكل مجمع ملزم مع endoribonuclease Las1، الذي يشقوق الداخلية المناسخة 2 (ITS2) من الجيش الملكي النيبالي قبل الريبوسوم3. انشقاق ITS2 بواسطة Las1 يولد منتج إيواء 5 'الهيدروكسيل التي هي في وقت لاحق phosphorylated من قبل kinase Grc33. للتحقيق في النيوكليوتيد وخصوصية الركيزة من Grc3، كان مطلوبا اختبار غير مكلفة التي سمحت باختبار ركائز oligonucleotide مختلفة. ولذلك، تم تطوير مقايسة فوسفيجيلة PNK باستخدام ركائز مسمّاة بالفلورسنت. تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتحديد أن Grc3 يمكن الاستفادة من أي NTP لنشاط نقل الفوسفوريل، ولكن تفضل ATP24. هذا البروتوكول يكيف المقايسة الأصلية لقياس نشاط PNK من Grc3 على تقليد الحمض النووي الريبي لركيزة الحمض النووي الريبي (SC-ITS2، الجدول 1). أحد الجوانب الصعبة لهذا النهج القائم على الفلورسين هو الاعتماد على جلات البولي أكريلاميد الكبيرة لحل ركائز الفوسفور وغير الفوسفورية بشكل فعال. ويوفر البروتوكول تفاصيل محددة حول كيفية صب هذه المواد الهلامية الكبيرة وتجنب المزالق الشائعة عند القيام بذلك.
يتطلب العمل مع الحمض النووي الريبي عناية خاصة لأنه معرض بشدة للتدهور. هناك خطوات وقائية بسيطة يمكن للمرء أن تتخذ للحد من التلوث ريبونوكليس. محطة عمل منفصلة الحمض النووي الريبي التي يمكن علاجها بسهولة مع عامل التنظيف RNase التي تحتوي على مثبطات غالبا ما تكون مفيدة. من الضروري ارتداء القفازات دائمًا عند التعامل مع العينات واستخدام المواد الاستهلاكية المعتمدة الخالية من RNase. لأن المياه هي مصدر آخر للتلوث، فمن الأفضل استخدام المياه النقية الطازجة وتعقيم جميع الحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNKs) هي إنزيمات تحفز الفسفر من نهاية الهيدروكسيل 5 'من الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligonucleotides. ويمكن قياس نشاط الـ PNK باستخدام نهج مباشرة أو غير مباشرة. يُعرض هنا نهج مباشر في المختبر لقياس نشاط PNK الذي يعتمد على الركيزة القلوية ذات التسمية الفلورية وأوليغونوكليوتيد وبوليكريلاميد هلام الكهرباء. يوفر هذا النهج القرار من المنتجات الفوسفورية مع تجنب استخدام ركائز radiolabeled. البروتوكول تفاصيل كيفية إعداد تفاعل الفوسفور، وإعداد وتشغيل المواد الهلامية بوليكلايد كبيرة، وقياس منتجات التفاعل. الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا المقايسة هو صب وتشغيل المواد الهلامية بوليكريلايد كبيرة; وبالتالي، يتم توفير تفاصيل هامة للتغلب على الصعوبات المشتركة. تم تحسين هذا البروتوكول لGrc3، وهو PNK الذي يتجمع في مجمع معالجة الحمض النووي الريبي الإلزامي مع شريكه الملزم، النوى Las1. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لقياس نشاط الإنزيمات PNK الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الفحص لتحديد آثار مختلف مكونات التفاعل، مثل ثلاثي الفوسفات النووي، والأيونات المعدنية، وأوليغونوكليوتيدات.

يظهر في الشكل 1هلام denaturing ممثل ناجح من المعايرة من ATP مع كمية ثابتة من مجمع Las1-Grc3 . إضافة انزيم أدى إلى انشقاق RNA بوساطة لاس1 من الركيزة الحمض النووي الريبي SC-ITS2، مما أدى إلى جزء RNA محدد (5-OH C2 RNA). عند إضافة ATP، تم فسفور شظايا الحمض النووي الريبي C2 بواسطة Grc3 PNK (5-P C2...

Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

يصف هذا البروتوكول مقايسة غير نشطة لقياس نشاط كيناز من كينازات البولي نوكليوتيد (PNKs) على ركائز الحمض النووي والحمض النووي الريبي الصغيرة.

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الفوسفور من نهاية خمسة رئيس من جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من قبل فئة خاصة من الإنزيمات المعروفة باسم كيناز متعدد النوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن لديه القرار للكشف عن تغييرات صغيرة جدا في الحمض النووي وركائز الحمض النووي الريبي. تبدأ من خلال إعداد ردود الفعل كيناز انزيم الحمض النووي الريبي.لكل رد فعل، والجمع بين ميكرولتر واحد من 500 الركيزة الحمض النووي الريبي نانومولار. 8.3 ميكرولترات من 130 نانوموللار آخر واحد، GRC ثلاثة و 0.2 ميكرولترات من خمسة ملليمولار EDTA. تعيين كتلة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.ثم مزيج 0.5 ميكرولترات من مخزون ATP الفرعية من سلسلة تركيز مع خليط انزيم RNA واحد ووضع التفاعل على كتلة الحرارة. مواصلة خلط ردود الفعل ووضعها على كتلة الحرارة في عشر فترات ثانية. بعد 60 دقيقة حضانة على كتلة الحرارة، وتروي كل رد فعل عن طريق رفع عليه مع 10 ميكرولترات من صبغة تحميل اليوريا.قم بإجراء تحليل المصب على الفور أو تخزين ردود الفعل عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية ليتم تحليلها في وقت لاحق. لإعداد 15٪ denaturing محلول هلام الأكريلاميد، والجمع بين 22.5 ملليلتر من ما قبل مختلطة 40٪ 29 إلى حل واحد أكريلاميد / مكرر الأكريلاميد. ستة ملليلترات من عشرة x TBE.28.8 غرام من اليوريا. و RNase المياه مجانا إلى حجم إجمالي قدره 59 ملليلتر. ثم يحرك بلطف الحل.سخني المحلّل في الميكروويف لمدة 20 ثانية. اثارة عليه وإعادته على الفور إلى الميكروويف لمدة 20 ثانية أخرى. يحرك بلطف الحل حتى يتم حل اليوريا تماما.ضع كوب الزجاج في حمام ماء ضحل ، يحتوي على الماء البارد لمدة خمس دقائق ، مع التأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بقارب الزجاج أعلى من مستوى الحل داخل كوب الزجاج. عندما يكون الحل بارد، تصفية وإزالة الغاز مع 0.2 اثنين من وحدة الترشيح ميكرومتر المتاح لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية. اغسلي لوحة زجاجية قصيرة وطويلة بالصابون والماء ثم رش كل طبق بنسبة 95٪ الإيثانول وامسحي الزجاج لإزالة أي رطوبة.رفع لوحة طويلة قبالة أعلى مقاعد البدلاء عن طريق وضعه على رأس مربع. ثم ضع 0.4 ملليمتر الفواصل على طول حواف طويلة من لوحة. وضع لوحة قصيرة على رأس لوحة طويلة، والتأكد من أن حواف لوحة قصيرة، لوحة طويلة والفواصل هي الانحياز.ثم المشبك كل جانب مع ثلاثة المشابك المعدنية متباعدة بالتساوي. أضف 24 ميكرولترات من TEMED إلى محلول الأكريلاميد واخلطه. ثم إضافة 600 ميكرولترات من 10٪ APS وعلى الفور صب الحل بين لوحات الزجاج.صب حل الاكريلاميد بين شطيرة لوحة الزجاج يمكن أن يكون تحديا حقا. لتجنب فقاعات الهواء، اضغط على شطيرة لوحة الزجاج أثناء صب الحل الخاص بك. إضافة بعناية نظيفة 32-جيدا مشط إلى الجزء العلوي من شطيرة لوحة زجاجية.واسمحوا الأكريلاميد البلمرة لمدة 30 دقيقة. لتشغيل الجل، تعيين كتلة الحرارة إلى 75 درجة مئوية. إزالة المشابك المعدنية.وغسل جيدا وتجفيف شطيرة لوحة الزجاج. وضع شطيرة لوحة وجهاز هلام مع لوحة قصيرة تواجه إلى الأمام وإعداد 0.5 X TBE تشغيل العازلة من خلال الجمع بين 100 ملليلتر من 10 X TBE مع 1.9 لتر من المياه الحرة RNase. إضافة 600 ملليلتر من المخزن المؤقت تشغيل إلى الغرف العليا والسفلى من الجهاز.قم بإزالة المشط بلطف من الجل وشطف الآبار جيدًا باستخدام حقنة. تشغيل ما قبل هلام في 50 واط لمدة 30 دقيقة. ثم شطف الآبار مرة أخرى.آخر تدور ردود الفعل إخماد واحتضان لهم في 75 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. كرر نبض تدور وتحميل على الفور 10 ميكرولترات من كل عينة على هلام. ثم تشغيل هلام لمدة ثلاث ساعات في 50 واط.عندما انتهت المدى، إيقاف التيار الكهربائي واستنزاف الغرفة العليا للجهاز. غسل وتجفيف الجانب الخارجي من شطيرة لوحة الزجاج. ثم غطيها بورق ونقلها إلى ماسح ليزر للتصوير.جبل شطيرة لوحة الزجاج على خشبة المسرح من الماسح الضوئي بالليزر. تعيين الإثارة وأطوال موجية الانبعاثات للأرضية المطلوبة لصورة هلام. يظهر هنا هو ممثل هلام denaturing ناجحة من المعايرة ATP مع كمية ثابتة من آخر GRC ثلاثة مجمع.إضافة الإنزيم أدى إلى آخر واحد توسطت الجيش الملكي النيبالي انشقاق من Saccharomyces cerevisiae ITS اثنين من الركيزة RNA، مما أدى إلى جزء RNA محددة. عند إضافة ATP، تم فسفور شظايا الحمض النووي الريبي C2 بواسطة GrC3 PNK. لتصور الفسففور من شظايا الحمض النووي الريبي C2، تم رسم الكمية النسبية من الحمض النووي الريبي C2 غيرphosphorylated وفسفورية ضد تركيز ATP.ممثلنا غير ناجحة هلام denaturing يظهر هنا. وتحتوي الركيزة الـ 21 من النيوكليوتيدات RNA على منتجات تحلل، تتداخل مع المنتج الفوسفوري وجعلت من المستحيل تحديد الفوسفور بدقة. وعلى النقيض من ذلك، يمكن تحليل أدنى ناتج لتحلل الحمض النووي الريبي بنجاح لأن هذه المنطقة من الجل لم تتضمن أي أنواع إضافية من الحمض النووي الريبي تعوق التحديد الكمي الدقيق لنظيرها الفوسفوري.أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا البروتوكول هو شطف آبار هلام لضمان تحميل حتى من العينة الخاصة بك. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجربة دوران RNA. لقياس معدلات تحلل الحمض النووي الريبي، غالباً ما يشير التفسيّر إلى بدء تحلل الحمض النووي الريبي.هذه التقنية تمهد الطريق للإجابة على الأسئلة التفصيلية حول خصوصية الأنشطة والحركات من الكنايات المتعددة النوى.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

حكام الحمض النووي المزدوج لدراسة آلية نقل ريبوسم مع قرار النيوكليوتيد واحد

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

باستخدام محلل الجريان خارج الخلية لقياس التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده اثناء الماوس العنبر التقوية

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...