Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Vi takker Dr. Andrew Sikkema og Andrea Kaminski for deres kritiske læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health Intramural Research Program; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S) og canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 til M.C.P).

1. Forberedelse
<ol><li>Forbered buffer og reagenser.<ol>
<li>Der skal laves 1x reaktionsbuffer ved at kombinere 20 μL 2 M Tris (pH = 8,0), 40 μL 5 M natriumchlorid, 2,5 μL 2 M magnesiumchlorid, 100 μL på 50 % (v/v) glycerol og RNase-frit vand for at nå et samlet volumen på 1 ml mL.</li>
		<li>Der skal laves urinstofbelastningsfarve ved at kombinere 4,8 g urinstof, 200 μL 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL μL 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) bromophenolblå, og RNasefrit vand for at nå et samlet volumen på 10...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Beskrevet er en analyse til at måle kinase aktivitet Grc3 PNK på fluorescerende mærket nukleotid substrater. Denne protokol kan anvendes til at karakterisere andre PNK enzymer ved at tilpasse reaction buffer og oligonucleotid substrat. F.eks. kræver protokollen en sporingsmængde af EDTA. Tilføjelsen af EDTA er gavnlig af to grunde: For det første favoriserer denne tilgang magnesiumbundet Grc3 ved at forhindre enzymet i at binde sig til at spore mængder af forurenende metaller i blandingen. For det andet hæmmer e...

Polynukleotidkinider (PNK) spiller en afgørende rolle i mange DNA- og RNA-behandlingsveje, såsom DNA-reparation og ribosomsamling1,2,,3,4,5. Disse grundlæggende enzymer katalyserer overførslen af terminalen (gamma) monofosfat fra en nukleosid tripfosfat (NTP, oftest ATP) til 5 ' hydroxyl ende af et nukleotid substrat. En af de mest vel karakteriseret PNKs er bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat specificitet og er stærkt udnyttet af molekylærbiologi labs til at indarbejde radioaktive isotop etiketter på 5 endestation af en DNA eller RNA substrat6,7,8,9,10,11,12. Et andet eksempel på en PNK enzym er CLP1, som findes i Eukarya, Eubacteria, og Archaea, og er involveret i flere RNA behandling veje4,13,14,15.
Historisk set er de fleste analyser, der måler polynukleotid kinase aktivitet er afhængige af radioaktiv isotop mærkning og efterfølgende autoradiografi5,16. I de senere år er der udviklet en række yderligere analyser til måling af PNK-aktivitet, herunder enkeltmolekyle tilgange, mikrochip elektroforese, molekylære beacons, samt kolortrimetriske og luminescens-baserede analyser17,18,19,20,21,22. Mens mange af disse nye tilgange giver forbedret detektion grænser og undgå brugen af radioaktivitet, hver har ulemper, såsom omkostninger, afhængighed af immobiliseret harpiks, og begrænsninger i substrat valg.
Grc3 er en polynukleotid kinase , der spiller en central rolle i behandlingen af præ-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 danner et obligate kompleks med endoribonuclease Las1, som kløver den interne transskriberede Spacer 2 (ITS2) af pre-ribosomal RNA3. Spaltning af ITS2 af Las1 genererer et produkt, der huser en 5 ' hydroxyl, der efterfølgende fosforyleret af Grc3 kinase3. For at undersøge nukleotid og substrat specificitet af Grc3, en billig analyse, der tillod test af forskellige oligonukleotid substrater var påkrævet. Derfor blev der udviklet en PNK-fosforyleringsanalyse ved hjælp af fluorescerende mærkede underlag. Denne analyse blev med succes brugt til at bestemme, at Grc3 kan udnytte enhver NTP for fosforyl overførsel aktivitet, men favoriserer ATP24. Denne protokol tilpasser den oprindelige analyse til at måle PNK aktivitet Grc3 på en RNA efterligne af sin præ-ribosomal RNA substrat (SC-ITS2, Tabel 1). Et udfordrende aspekt af denne fluorescens-baserede tilgang er afhængigheden af store polyarylamid geler til effektivt at løse fosforylerede og ikke-fosforede substrater. Protokollen indeholder specifikke detaljer om, hvordan man hælder disse store geler og undgå almindelige faldgruber, når du gør det.
Arbejde med RNA kræver særlig omhu, fordi det er stærkt modtagelige for nedbrydning. Der er enkle forebyggende skridt man kan tage for at begrænse ribonuclease forurening. En separat RNA-arbejdsstation, der let kan behandles med et RNase-inhibitor-holdige rengøringsmiddel, er ofte nyttig. Det er altid nødvendigt at bære handsker ved håndtering af prøver og brug af RNase-fri certificerede forbrugsstoffer. Da vand er en anden almindelig forureningskilde, er det bedst at bruge frisk renset vand og sterilisere alle opløsninger ved hjælp af et 0,22 μm filter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Polynukleotidkinaser (PNKs) er enzymer, der katalyserer fosforyleringen af 5' hydroxylenden af DNA og RNA oligonukleotider. PNKs' aktivitet kan kvantificeres ved hjælp af direkte eller indirekte tilgange. Præsenteret her er en direkte, in vitro tilgang til at måle PNK aktivitet, der bygger på en fluorescerende mærket oligonukleotid substrat og polyacryamide gel elektroforese. Denne fremgangsmåde giver opløsning af fosforylerede produkter og samtidig undgå brugen af radioaktivt mærkede substrater. Protokollen beskriver, hvordan fosforyleringsreaktionen skal opsættes, forberede og køre store polyacryamidgeler og kvantificere reaktionsprodukterne. Den mest teknisk udfordrende del af denne analyse er at hælde og køre de store polyacryamid geler; der gives derfor vigtige detaljer for at overvinde fælles vanskeligheder. Denne protokol blev optimeret til Grc3, en PNK, der samler sig i et forpligtende præ-ribosomal RNA-behandlingskompleks med sin bindende partner, Las1-nukleasen. Denne protokol kan dog tilpasses til måling af andre PNK-enzymers aktivitet. Desuden kan denne analyse også ændres for at bestemme virkningerne af forskellige komponenter i reaktionen, såsom nukleosidens trefat, metalioner og oligonukleotider.

En vellykket repræsentativ denatureringsgel af en titrering af ATP med et fast antal Las1-Grc3-kompleks er vist i figur 1. Tilsætning af enzym resulterede i Las1-medieret RNA-spaltning af SC-ITS2 RNA-substratet, hvilket førte til et defineret RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Ved tilsætning af ATP blev C2 RNA-fragmentet fosforyleret af Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Ved denaturering af geler vandrer det fosforylerede RNA hurtigere end dets ufostænkede modstykke. Som v...

Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Denne protokol beskriver en ikke-radioaktiv analyse til måling af kinase aktivitet af polynukleotidkinaser (PNKs) på små DNA- og RNA-substrater.

Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Denne metode kan besvare centrale spørgsmål om fosforylering af de fem-prime ende af DNA eller RNA molekyler ved en særlig klasse af enzymer kendt som polynukleotid kinase. Den største fordel ved denne teknik er, at den har opløsningen til at detektere meget små ændringer i DNA- og RNA-substrater. Begynd med at forberede RNA-enzymets kinasereaktioner.For hver reaktion skal du kombinere en mikroliter på 500 nanomolar RNA-substrat. 8,3 mikroliter af 130 nanomolar sidste, GRC tre og 0,2 mikroliter af fem millimolar EDTA. Indstil varmeblokken til 37 grader Celsius.Bland derefter 0,5 mikroliter af en ATP-understrøm fra koncentrationsserien med en RNA-enzymblanding, og anfør reaktionen på varmeblokken. Fortsæt med at blande reaktionerne og placere dem på varmeblokken med ti sekunders mellemrum. Efter en 60 minutters inkubation på varmeblokken skal hver reaktion slukkes ved at spytte den med 10 mikroliter urinstofbelastningsfarvestof.Straks udføre downstream analyse eller gemme reaktionerne ved negative 20 grader Celsius, der skal analyseres på et senere tidspunkt. For at forberede en 15% denaturering acrylamid gel opløsning, kombinere 22,5 milliliter af præ-blandet 40%29 til en acrylamid / bis acrylamid opløsning. Seks milliliter af ti x TBE.28,8 gram urinstof. Og RNase frit vand til et samlet volumen på 59 milliliter. Rør derefter forsigtigt opløsningen.Opløsningen opvarmes i mikrobølgeovnen i 20 sekunder. Rør den om og vend den straks tilbage til mikrobølgeovnen i yderligere 20 sekunder. Rør forsigtigt opløsningen, indtil urinstofet er helt opløst.Anlænde glasbægeren i et lavt vandbad, der indeholder koldt vand i fem minutter, og sørg for, at niveauet af koldt vand omkring glasbægeren er over opløsningsniveauet inde i glasbægeret. Når opløsningen er afkølet, filtreres og afgasser den med en 0,2 to mikrometer engangsfiltreringsenhed for at fjerne partikler og mikroskopiske luftbobler. Vask en kort og lang glasplade med sæbe og vand derefter spray hver plade med 95% ethanol og tør glasset for at fjerne fugt.Løft den lange plade af bordpladen ved at placere den oven på en kasse. Placer derefter 0,4 millimeter afstandsedler langs pladens lange kanter. Læg den korte plade oven på den lange plade, og sørg for, at kanterne af den korte plade, lange plade og afstandsfraen er justeret.Derefter klemme hver side med tre jævnt fordelt metal klemmer. Tilføj 24 mikroliter TEMED til acrylamidopløsningen, og bland den. Derefter tilsættes 600 mikroliter på 10% APS og hæld straks opløsningen mellem glaspladerne.Hælde acrylamid løsning mellem glasplade sandwich kan være virkelig udfordrende. For at undgå luftbobler skal du trykke på glaspladesandwichen, mens du hælder din opløsning. Tilsæt forsigtigt en ren kam på 32 brønde til toppen af glaspladesandwichen.Og lad acrylamid at polymerisere i 30 minutter. For at køre gelen skal du indstille varmeblokken til 75 grader Celsius. Fjern metalklemmerne.Og vask og tør glaspladesandwich grundigt. Anvend pladesandwichen og gelapparatet med den korte plade vendt fremad og klargør 0,5 X TBE løbebuffer ved at kombinere 100 milliliter 10 X TBE med 1,9 liter RNase frit vand. Der tilsættes 600 milliliter løbebufferen til apparatets øvre og nedre kamre.Fjern forsigtigt kammen fra gelen og skyl brøndene grundigt med en sprøjte. For-kør gelen på 50 Watt i 30 minutter. Skyl derefter brøndene igen.Post spin dæmpningen reaktioner og inkubere dem ved 75 grader Celsius i tre minutter. Gentag pulsspinen, og indlæs straks 10 mikroliter af hver prøve på gelen. Kør derefter gelen i tre timer ved 50 Watt.Når løbet er færdigt, skal du slukke for strømforsyningen og tømme apparatets øverste kammer. Vask og tør den ydre side af glaspladen sandwich. Derefter dække det med folie og overføre det til en laserscanner til billedbehandling.Monter glaspladesandwichen på laserscannerens scene. Indstil excitation og emission bølgelængder for det ønskede gulv for og billede gelen. Vist her er en repræsentativ vellykket denaturering gel af en titrering af ATP med et fast beløb på sidste grc tre kompleks.Tilsætning af enzym resulterede i sidste medieret RNA-spaltning af Saccharomyces cerevisiae ITS to RNA-substrat, hvilket førte til et defineret RNA-fragment. Ved tilsætning af ATP blev C2 RNA-fragmentet fosforyleret af GrC3 PNK. For at visualisere fosforyleringen af C2 RNA-fragmentet blev den relative mængde uphosphorylated og fosforyleret C2 RNA afbildet mod ATP-koncentrationen.Vores repræsentant mislykket denaturering gel er vist her. Det 21 nukleotid RNA-substrat indeholdt nedbrydningsprodukter, som overlappede med det fosforylerede produkt og gjorde det umuligt præcist at kvantificere fosforylation. I modsætning hertil kunne det korteste RNA nedbrydningsprodukt analyseres med succes, fordi dette område af gelen ikke indeholdt yderligere RNA-arter, der hindrede nøjagtig kvantificering af dets fosforylerede modstykke.Vigtigst ting at huske, når du forsøger denne protokol er at skylle brønde af gelen for at sikre selv belastning af din prøve. Efter denne procedure kunne der udføres et RNA-omsætningseksperiment. For at måle satserne for RNA-nedbrydning signalerer fosforylering ofte initiering af RNA-nedbrydning.Denne teknik baner vejen for besvarelse af detaljerede spørgsmål om aktiviteterne specificitet og kinetik af polynukleotid kinaser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitative immunofluorescens foranstaltning globale lokaliseret Oversættelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dual DNA-linealer til at studere mekanismen af Ribosome translokation med enkelt-nukleotid opløsning

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...