Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Wij danken Dr. Andrew Sikkema en Andrea Kaminski voor hun kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Us National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 aan R.E.S) en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 tot M.C.P).

1. Voorbereiding
<ol><li>Buffer en reagentia voorbereiden.<ol>
<li>Maak 1x Reactiebuffer door 20 μL van 1 M Tris (pH = 8.0), 40 μL natriumchloride van 5 M, 2,5 μL van 2 M magnesiumchloride, 100 μL van 50% (v/v) glycerol en RNase-vrij water te combineren om een totaal volume van 1 mL te bereiken.</li>
		<li>Maak ureum ladingkleurstof door 4,8 g ureum te combineren, 200 μL van 1 M Tris (pH = 8.0), 20 μL van 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL van 1% (w/v) bromofenolblauw en RNase-vrij water om een totaal volume van 10 mL...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Beschreven is een test om kinase activiteit van Grc3 PNK te meten op fluorescerend gelabelde nucleotide substraten. Dit protocol kan worden toegepast om andere PNK enzymen te karakteriseren door de Reaction Buffer en oligonucleotide substraat aan te passen. Het protocol vraagt bijvoorbeeld om een traceerbedrag van EDTA. De toevoeging van EDTA is gunstig om twee redenen: Ten eerste, deze aanpak bevordert magnesium-gebonden Grc3 door te voorkomen dat het enzym te binden om hoeveelheden vervuilende metalen in het mengsel te...

Polynucleotide kinases (PNK) spelen een cruciale rol in veel DNA- en RNA-verwerkingstrajecten, zoals DNA-herstel en ribosoomassemblage1,2,,3,4,5. Deze fundamentele enzymen katalyseren de overdracht van het terminale (gamma) monofosfaat van een nucleoside triphosfaet (NTP, meestal ATP) naar het 5'hydroxyleinde van een nucleotideubstraat. Een van de meest goed gekarakteriseerde PNKs is bacteriofaag T4 PNK, die brede substraat specificiteit heeft en zwaar wordt gebruikt door moleculaire biologielaboratoria voor het opnemen van radioactieve isotopenlabels op het 5-eindpunt van een DNA- of RNA-substraat6,7,8,9,10,11,12. Een ander voorbeeld van een PNK-enzym is CLP1, dat wordt gevonden in Eukarya, Eubacteriën en Archaea, en is betrokken bij verschillende RNA-verwerkingstrajecten4,,13,,14,15.
Historisch gezien zijn de meeste tests die polynucleotide kinaseactiviteit meten afhankelijk van radioactieve isotopenetikettering endaaropvolgendeautoradiografie 5,16. In de afgelopen jaren zijn een aantal aanvullende tests ontwikkeld om de PNK-activiteit te meten, waaronder single molecule benaderingen, microchip elektroforese, moleculaire bakens, evenals colorimetrische en luminescentie-gebaseerde tests17,18,19,20,21,22. Hoewel veel van deze nieuwe benaderingen verbeterde detectielimieten bieden en het gebruik van radioactiviteit vermijden, heeft elk nadeel, zoals kosten, afhankelijkheid van geïmmobiliseerde hars en beperkingen in de keuze van het substraat.
Grc3 is een polynucleotide kinase die een centrale rol speelt bij de verwerking van preririmaal RNA2,3,23. Grc3 vormt een obligate complex met de endoribonuclease Las1, die de interne transcribed Spacer 2 (ITS2) van het pre-ribosomale RNA3splijt. Decolleté van de ITS2 door Las1 genereert een product met een 5'-hydroxyl dat vervolgens wordt gefossyleerd door de Grc3 kinase3. Om de nucleotide en substraatspecificiteit van Grc3 te onderzoeken, was een goedkope test nodig die het testen van verschillende oligonucleotide substraten mogelijk maakte. Daarom werd een PNK fosforylatietest ontwikkeld met fluorescerend gelabelde substraten. Deze test werd met succes gebruikt om te bepalen dat Grc3 elke NTP kan gebruiken voor fosforyloverdrachtactiviteit, maar bevoordeelt ATP24. Dit protocol past de oorspronkelijke test aan om de PNK-activiteit van Grc3 te meten op een RNA-nabootsing van het preririmaal RNA-substraat (SC-ITS2, tabel 1). Een uitdagend aspect van deze fluorescentie-gebaseerde aanpak is de afhankelijkheid van grote polyacrylamide gels om fosforyleerde en niet-phosphorylated substraten effectief op te lossen. Het protocol geeft specifieke details over hoe deze grote gels te gieten en te voorkomen dat gemeenschappelijke valkuilen wanneer dit te doen.
Werken met RNA vereist bijzondere zorg omdat het sterk gevoelig is voor afbraak. Er zijn eenvoudige preventieve stappen die men kan nemen om ribonuclease besmetting te beperken. Een apart RNA-werkstation dat gemakkelijk kan worden behandeld met een RNase-remmerhoudend reinigingsmiddel is vaak nuttig. Altijd handschoenen dragen bij het hanteren van monsters en het gebruik van RNase-vrije gecertificeerde verbruiksartikelen is noodzakelijk. Omdat water een andere veel voorkomende bron van verontreiniging is, is het het beste om vers gezuiverd water te gebruiken en alle oplossingen te steriliseren met behulp van een filter van 0,22 μm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) zijn enzymen die de fosforylatie van het 5'hydrcoxyleinde van DNA en RNA oligonunucleotiden katalyseren. De activiteit van PNKs kan worden gekwantificeerd met behulp van directe of indirecte benaderingen. Hier gepresenteerd is een directe, in vitro benadering om PNK activiteit die is gebaseerd op een fluorescerend gelabeld oligonucleotide substraat en polyacrylamide gel elektroforese te meten. Deze aanpak biedt een oplossing van de fosforgeyleerde producten en vermijdt het gebruik van radioactief gelabelde substraten. Het protocol beschrijft hoe de fosforylatiereactie in te stellen, grote polyacrylamidegels te bereiden en uit te voeren, en kwantificeren van de reactieproducten. Het meest technisch uitdagende deel van deze test is het gieten en uitvoeren van de grote polyacrylamide gels; Er worden dus belangrijke details verstrekt om gemeenschappelijke moeilijkheden te overwinnen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor Grc3, een PNK die zich assembleert tot een verplicht pre-ribosomale RNA verwerkingscomplex met zijn bindingspartner, de Las1 nuclease. Dit protocol kan echter worden aangepast om de activiteit van andere PNK-enzymen te meten. Bovendien kan deze test ook worden gewijzigd om de effecten van verschillende componenten van de reactie te bepalen, zoals het nucleoside-sfosfaat, metaalionen en oligonucleotiden.

Een succesvolle representatieve denaturerende gel van een titratie van ATP met een vaste hoeveelheid Las1-Grc3 complex wordt weergegeven in figuur 1. Toevoeging van enzym resulteerde in Las1-gemedieerd RNA decolleté van het SC-ITS2 RNA substraat, wat leidde tot een gedefinieerd RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Na toevoeging van ATP werd het C2 RNA-fragment gefossyleerd door Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Bij denatureringsgels migreert het fosforyleerde RNA sneller dan zi...

Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Deze methode kan antwoord geven op belangrijke vragen over de fosforylatie van het vijfste hoofdeinde van DNA- of RNA-moleculen door een speciale klasse van enzymen die bekend staan als polynucleotide kinase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de resolutie heeft om zeer kleine veranderingen in DNA en RNA substraten te detecteren. Begin met het voorbereiden van de RNA enzym kinase reacties.Combineer voor elke reactie één microliter van 500 nanomolar RNA-substraat. 8,3 microliter van 130 nanomolar laatste, GRC drie en 0,2 microliter van vijf millimolar EDTA. Stel het hitteblok in op 37 graden Celsius.Meng vervolgens 0,5 microliter van een ATP-subvoorraad uit de concentratiereeks met één RNA-enzymmengsel en plaats de reactie op het warmteblok. Blijf de reacties mengen en plaats ze met tussenpozen van tien seconden op het warmteblok. Na een incubatie van 60 minuten op het warmteblok, blus elke reactie door het te spiking met 10 microliters van ureum ladingkleurstof.Voer onmiddellijk downstream-analyse uit of bewaar de reacties op negatieve 20 graden Celsius die op een later tijdstip moeten worden geanalyseerd. Om een 15% denaturering acrylamide gel oplossing voor te bereiden, combineer 22,5 milliliter voorgemixte 40%29 tot een acrylamide/bis acrylamide oplossing. Zes milliliter van tien x TBE.28,8 gram ureum. En RNase vrij water tot een totaal volume van 59 milliliter. Roer vervolgens voorzichtig de oplossing.Verwarm de oplossing gedurende 20 seconden in de magnetron. Roer het en onmiddellijk terug naar de magnetron voor nog eens 20 seconden. Roer de oplossing voorzichtig door tot de ureum volledig is opgelost.Plaats het glazen bekerglas in een ondiep waterbad, met koud water gedurende vijf minuten, ervoor te zorgen dat het niveau van koud water rond het glazen bekerglas is boven het niveau van de oplossing in het glazen bekerglas. Wanneer de oplossing koel is, filter en ontgas het met een 0.2 twee micrometer wegwerpfiltratie-eenheid om deeltjes en microscopische luchtbellen te verwijderen. Was een korte en lange glasplaat met zeep en water en spuit vervolgens elke plaat met 95% ethanol en veeg het glas af om vocht te verwijderen.Verhoog de lange plaat van de bank door het op een doos te plaatsen. Plaats vervolgens 0,4 millimeter afstandhouders langs de lange randen van de plaat. Leg de korte plaat op de lange plaat, zorg ervoor dat de randen van de korte plaat, lange plaat en afstandhouders zijn uitgelijnd.Klem vervolgens elke kant met drie gelijkmatig verdeelde metalen klemmen. Voeg 24 microliter TEMED toe aan de acrylamideoplossing en meng het. Voeg vervolgens 600 microliter van 10% APS toe en giet de oplossing onmiddellijk tussen de glasplaten.Het gieten van de acrylamide oplossing tussen de glasplaat sandwich kan echt een uitdaging zijn. Om luchtbellen te voorkomen, tik je op de sandwich van de glasplaat terwijl je je oplossing giet. Voeg voorzichtig een schone 32-well kam aan de bovenkant van de glazen plaat sandwich.En laat de acrylamide 30 minuten polymeriseren. Om de gel te laten draaien, zet je het hitteblok op 75 graden Celsius. Verwijder de metalen klemmen.En grondig wassen en drogen van de glazen plaat sandwich. Plaats de plaatsandwich en het gelapparaat met de korte plaat naar voren gericht en bereid 0,5 X TBE loopbuffer door 100 milliliter van 10 X TBE te combineren met 1,9 liter RNase vrij water. Voeg 600 milliliter van de loopbuffer toe aan de boven- en onderkamers van het apparaat.Verwijder voorzichtig de kam uit de gel en spoel de putten grondig af met een spuit. Pre-run de gel op 50 Watt gedurende 30 minuten. Spoel vervolgens de putten opnieuw.Post spin de quench reacties en broeden ze op 75 graden Celsius gedurende drie minuten. Herhaal de pulsspin en laad onmiddellijk 10 microliter van elk monster op de gel. Dan draait de gel voor drie uur op 50 Watt.Wanneer de run is voltooid, schakelt u de voeding uit en laat u de bovenste kamer van het apparaat uitlekken. Was en droog de buitenkant van de glazen plaat sandwich. Bedek het vervolgens met folie en breng het over naar een laserscanner voor beeldvorming.Monteer de sandwich van de glasplaat op het podium van de laserscanner. Stel de excitatie en emissiegolflengten in voor de gewenste vloer voor en beeld de gel. Hier getoond is een representatieve succesvolle denaturerende gel van een titratie van ATP met een vaste hoeveelheid laatste GRC drie complex.Toevoeging van enzym resulteerde in de laatste bemiddelde RNA decolleté van de Saccharomyces cerevisiae zijn twee RNA substraat, wat leidt tot een gedefinieerd RNA fragment. Na toevoeging van ATP werd het C2 RNA-fragment gefossyleerd door GrC3 PNK. Om de fosforylatie van het C2 RNA-fragment te visualiseren, werd de relatieve hoeveelheid niet-phosphorylated en fosforylated C2 RNA uitgezet tegen de ATP-concentratie.Onze representatieve niet-gesuccesvolle deaturering gel wordt hier getoond. Het 21 nucleotide RNA-substraat bevatte afbraakproducten, die overlappen met het fosforyleerde product en het onmogelijk maakten om fosforylatie nauwkeurig te kwantificeren. Het kortste RNA-afbraakproduct kon daarentegen met succes worden geanalyseerd omdat dit gebied van de gel geen extra RNA-soorten bevatte die een nauwkeurige kwantificering van zijn fosforyleerde tegenhanger belemmerden.Het belangrijkste om te onthouden bij een poging dit protocol is om de putten van de gel te spoelen om zelfs het laden van uw monster te garanderen. Volgens deze procedure kon een RNA-omzetexperiment worden uitgevoerd. Om de snelheid van RNA-afbraak te meten, signaleert fosforylatie vaak initiatie van RNA-afbraak.Deze techniek maakt de weg vrij voor het beantwoorden van gedetailleerde vragen over de activiteiten specificiteit en kinetiek van polynucleotide kinases.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...