Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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Wir danken Dr. Andrew Sikkema und Andrea Kaminski für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health Intramural Research Program unterstützt; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 an R.E.S) und die Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 bis M.C.P).

1. Vorbereitung
<ol><li>Puffer und Reagenzien vorbereiten.<ol>
<li>Machen Sie 1x Reaktionspuffer, indem Sie 20 l von 1 M Tris (pH = 8,0), 40 l 5 m Natriumchlorid, 2,5 l 2 m Magnesiumchlorid, 100 l 50 % (v/v) Glycerin und RNase-freies Wasser kombinieren, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen.</li>
		<li>Harnstoff-Ladefarbstoff durch Kombination von 4,8 g Harnstoff, 200 l 1 M Tris (pH = 8,0), 20 l 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) Bromophenolblau und RNase-freiem Wasser für ein Gesamtvolumen von 10 ml.</li>
		...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. 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M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Beschrieben ist ein Test zur Messung der Kinase-Aktivität von Grc3 PNK auf fluoreszierend markierten Nukleotidsubstraten. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um andere PNK-Enzyme durch Anpassung des Reaktionspuffers und des Oligonukleotidsubstrats zu charakterisieren. Beispielsweise fordert das Protokoll eine Rückverfolgungsmenge von EDTA. Die Zugabe von EDTA ist aus zwei Gründen von Vorteil: Erstens begünstigt dieser Ansatz Magnesium-gebundene Grc3, indem verhindert wird, dass das Enzym an die Rückverfolgbarke...

Polynukleotid-Kiinasen (PNK) spielen in vielen DNA- und RNA-Verarbeitungswegen eine entscheidende Rolle, wie z. B. DNA-Reparatur und Ribosome-Montage1,2,3,4,5. Diese grundlegenden Enzyme katalysieren die Übertragung des terminalen (Gamma)-Monophosphats von einem Nukleosidtriphosphat (NTP, am häufigsten ATP) auf das 5' Hydroxylende eines Nukleotidsubstrats. Eines der am besten charakterisierten PNKs ist das Bakteriophagen T4 PNK, das eine breite Substratspezifität hat und von molekularbiologischen Labors stark genutzt wird, um radioaktive Isotopenetiketten auf den 5 Endpunkt eines DNA- oder RNA-Substrats6,7,8,9,10,11,12zu integrieren. Ein weiteres Beispiel für ein PNK-Enzym ist CLP1, das in Eukarya, Eubacteria und Archaea vorkommt und in mehrere RNA-Verarbeitungswege4,13,14,15verwickelt ist.
Historisch gesehen sind die meisten Assays, die die Aktivität der Polynukleotidkinase messen, von der Kennzeichnung radioaktiver Isotope und der anschließenden Autoradiographie5,16abhängig. In den letzten Jahren wurden eine Reihe zusätzlicher Assays entwickelt, um die PNK-Aktivität zu messen, darunter Einzelmolekülansätze, Mikrochip-Elektrophorese, molekulare Leuchttürme sowie kolorimetrische und lumineszenzbasierte Assays17,18,19,20,21,22. Während viele dieser neuen Ansätze verbesserte Nachweisgrenzen bieten und den Einsatz von Radioaktivität vermeiden, hat jeder Nachteile, wie Kosten, Abhängigkeit von immobilisiertem Harz und Einschränkungen bei der Substratauswahl.
Grc3 ist eine Polynukleotidkinase, die eine zentrale Rolle bei der Verarbeitung von präribosomaler RNA2,3,23spielt. Grc3 bildet einen obligaten Komplex mit der Endoribonuklease Las1, die den Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) der präribosomalen RNA3spaltet. Die Spaltung des ITS2 durch Las1 erzeugt ein Produkt, das ein 5' Hydroxyl beherbergt, das anschließend von der Grc3-Kinase3phosphoryliert wird. Um die Nukleotid- und Substratspezifität von Grc3 zu untersuchen, war ein kostengünstiger Test erforderlich, der das Testen verschiedener Oligonukleotidsubstrate ermöglichte. Daher wurde ein PNK-Phosphorylierungstest mit fluoreszierend markierten Substraten entwickelt. Dieser Test wurde erfolgreich verwendet, um festzustellen, dass Grc3 jedes NTP für Phosphoryltransferaktivität nutzen kann, begünstigt aber ATP24. Dieses Protokoll passt den ursprünglichen Assay an, um die PNK-Aktivität von Grc3 auf einer RNA-Mimik seines präribosomalen RNA-Substrats zu messen (SC-ITS2, Tabelle 1). Ein herausfordernder Aspekt dieses fluoreszenzbasierten Ansatzes ist die Abhängigkeit von großen Polyacrylamid-Gelen, um phosphorylierte und nicht phosphorylierte Substrate effektiv zu lösen. Das Protokoll enthält spezifische Details darüber, wie diese großen Gele gegossen werden und dabei häufige Fallstricke vermieden werden können.
Die Arbeit mit RNA erfordert besondere Sorgfalt, da sie stark anfällig für Degradation ist. Es gibt einfache vorbeugende Schritte, um ribonuklease-Kontamination zu begrenzen. Eine separate RNA-Workstation, die leicht mit einem RNase-Inhibitor-haltigen Reinigungsmittel behandelt werden kann, ist oft hilfreich. Bei der Handhabung von Proben und der Verwendung von RNase-freien zertifizierten Verbrauchsmaterialien ist immer Handschuhe zu tragen. Da Wasser eine weitere häufige Kontaminationsquelle ist, ist es am besten, frisch gereinigtes Wasser zu verwenden und alle Lösungen mit einem 0,22 m-Filter zu sterilisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Polynukleotid-Kinasen (PNKs) sind Enzyme, die die Phosphorylierung des 5'-Hydroxylendes von DNA- und RNA-Oligonukleotiden katalysieren. Die Aktivität von PNKs kann mit direkten oder indirekten Ansätzen quantifiziert werden. Hier wird ein direkter In-vitro-Ansatz zur Messung der PNK-Aktivität vorgestellt, der auf einem fluoreszierend markierten Oligonukleotidsubstrat und polyacrylamidgelelektrophorese beruht. Dieser Ansatz ermöglicht die Auflösung der phosphorylierten Produkte bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung von radioaktiv markierten Substraten. Das Protokoll beschreibt, wie die Phosphorylierungsreaktion eingerichtet, große Polyacrylamid-Gele zubereitet und betrieben werden und die Reaktionsprodukte quantifiziert werden. Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Assays ist das Gießen und Betreiben der großen Polyacrylamidgele; daher werden wichtige Details zur Überwindung gemeinsamer Schwierigkeiten bereitgestellt. Dieses Protokoll wurde für Grc3 optimiert, ein PNK, das sich mit seinem Bindungspartner, der Las1-Nuklease, zu einem obligaten präribosomalen RNA-Verarbeitungskomplex zusammensetzt. Dieses Protokoll kann jedoch angepasst werden, um die Aktivität anderer PNK-Enzyme zu messen. Darüber hinaus kann dieser Test auch modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener Komponenten der Reaktion zu bestimmen, wie z. B. Nukleosidtriphosphat, Metallionen und Oligonukleotide.

Abbildung 1zeigt ein erfolgreiches repräsentatives Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge an Las1-Grc3-Komplex . Die Zugabe des Enzyms führte zu einer Las1-vermittelten RNA-Spaltung des SC-ITS2-RNA-Substrats, was zu einem definierten RNA-Fragment (5-OH C2 RNA) führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch Grc3 PNK (5-P C2 RNA) phosphoryliert. Bei der Denaturierung von Gelen wandert die phosphorylierte RNA schneller a...

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Diese Methode kann wichtige Fragen zur Phosphorylierung des Fünf-Prim-Endes von DNA- oder RNA-Molekülen durch eine spezielle Klasse von Enzymen beantworten, die als Polynukleotidkinase bekannt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Auflösung hat, sehr kleine Veränderungen in DNA- und RNA-Substraten zu erkennen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der RNA-Enzymkinase-Reaktionen.Kombinieren Sie für jede Reaktion einen Mikroliter 500 nanomolarer RNA-Substrat. 8,3 Mikroliter 130 Nanomolar zuletzt, GRC drei und 0,2 Mikroliter von fünf Millimolar EDTA. Stellen Sie den Wärmeblock auf 37 Grad Celsius ein.Mischen Sie dann 0,5 Mikroliter eines ATP-Unterbestands aus der Konzentrationsreihe mit einem RNA-Enzymgemisch und legen Sie die Reaktion auf den Wärmeblock. Mischen Sie die Reaktionen weiter und legen Sie sie in zehn Sekunden intervallen auf den Wärmeblock. Nach einer 60-minütigen Inkubation auf dem Wärmeblock, löschen Sie jede Reaktion, indem Sie es mit 10 Mikroliter Harnstoff-Ladefarbstoff.Führen Sie sofort eine nachgelagerte Analyse durch oder speichern Sie die Reaktionen bei negativen 20 Grad Celsius, um zu einem späteren Zeitpunkt analysiert zu werden. Zur Herstellung einer 15%denaturierenden Acrylamid-Gel-Lösung 22,5 Milliliter vorgemischter 40%29 zu einer Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung kombinieren. Sechs Milliliter von zehn x TBE.28,8 Gramm Harnstoff. Und RNase freies Wasser mit einem Gesamtvolumen von 59 Millilitern. Dann rühren Sie die Lösung vorsichtig.Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle für 20 Sekunden. Rühren Sie es und geben Sie es sofort für weitere 20 Sekunden in die Mikrowelle zurück. Rühren Sie die Lösung vorsichtig, bis der Harnstoff vollständig gelöst ist.Legen Sie den Glasbecher in ein flaches Wasserbad, das fünf Minuten lang kaltes Wasser enthält, und stellen Sie sicher, dass der Gehalt an kaltem Wasser, das den Glasbecher umgibt, über dem Niveau der Lösung im Inneren des Glasbechers liegt. Wenn die Lösung kühl ist, filtern und entgasen Sie sie mit einer Einwegfiltereinheit von 0,2 Mikrometern, um Partikel und mikroskopische Luftblasen zu entfernen. Waschen Sie eine kurze und lange Glasplatte mit Seife und Wasser, dann sprühen Sie jede Platte mit 95% Ethanol und wischen Sie das Glas, um feuchtigkeit zu entfernen.Heben Sie die lange Platte von der Bank oben, indem Sie sie auf eine Box legen. Positionieren Sie dann 0,4 Millimeter Abstandshalter entlang der langen Kanten der Platte. Legen Sie die kurze Platte auf die lange Platte, um sicherzustellen, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind.Dann klemmen Sie jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklemmen. 24 Mikroliter TEMED in die Acrylamidlösung geben und mischen. Dann 600 Mikroliter 10%APS hinzufügen und sofort die Lösung zwischen die Glasplatten gießen.Das Gießen der Acrylamidlösung zwischen das Glasplatten-Sandwich kann wirklich eine Herausforderung sein. Um Luftblasen zu vermeiden, tippen Sie auf das Glasplatten-Sandwich, während Sie Ihre Lösung gießen. Fügen Sie vorsichtig einen sauberen 32-Well-Kamm an die Oberseite des Glasplatten-Sandwiches.Und lassen Sie das Acrylamid für 30 Minuten polymerisieren. Um das Gel auszuführen, stellen Sie den Wärmeblock auf 75 Grad Celsius ein. Entfernen Sie die Metallklemmen.Und gründlich waschen und trocknen Sie die Glasplatte Sandwich. Positionieren Sie das Plattensandwich und das Gelgerät mit der kurzen Platte nach vorne und bereiten Sie 0,5 X TBE Laufpuffer vor, indem Sie 100 Milliliter 10 X TBE mit 1,9 Literr RNase-freiem Wasser kombinieren. Fügen Sie 600 Milliliter des Laufpuffers in die oberen und unteren Kammern des Geräts.Entfernen Sie den Kamm vorsichtig vom Gel und spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze ab. Führen Sie das Gel mit 50 Watt für 30 Minuten vor. Dann spülen Sie die Brunnen wieder ab.Drehen Sie die Löschreaktionen und bebrüten sie drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Pulsspin und laden Sie sofort 10 Mikroliter jeder Probe auf das Gel. Dann laufen Sie das Gel für drei Stunden bei 50 Watt.Wenn der Lauf beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Geräts. Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplatten-Sandwiches. Dann mit Folie bedecken und zur Bildgebung auf einen Laserscanner übertragen.Montieren Sie das Glasplatten-Sandwich auf die Bühne des Laserscanners. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen für den gewünschten Boden für das Gel ein und stellen Sie es ab. Hier ist ein repräsentatives erfolgreiches Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge von zuletzt einem GRC drei Komplex gezeigt.Die Zugabe des Enzyms führte zu einer letzten vermittelten RNA-Spaltung des Saccharomyces cerevisiae ITS zwei RNA-Substrat, was zu einem definierten RNA-Fragment führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch GrC3 PNK phosphoryliert. Um die Phosphorylierung des C2-RNA-Fragments zu visualisieren, wurde die relative Menge an nicht phosphorylierter und phosphorylierter C2-RNA gegen die ATP-Konzentration dargestellt.Unser repräsentatives erfolgloses Denaturierungsgel wird hier gezeigt. Das 21 Nukleotid-RNA-Substrat enthielt Abbauprodukte, die sich mit dem phosphorylierten Produkt überlappten und eine genaue Quantifizierung der Phosphorylierung unmöglich machten. Im Gegensatz dazu konnte das kürzeste RNA-Abbauprodukt erfolgreich analysiert werden, da dieser Bereich des Gels keine zusätzlichen RNA-Arten enthielt, die eine genaue Quantifizierung seines phosphorylierten Gegenstücks behinderten.Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Protokolls beachten sollten, ist, die Brunnen des Gels zu spülen, um eine gleichmäßige Belastung Ihrer Probe zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren konnte ein RNA-Umsatzexperiment durchgeführt werden. Um die Raten des RNA-Abbaus zu messen, signalisiert die Phosphorylierung oft die Initiierung des RNA-Abbaus.Diese Technik ebnet den Weg für die Beantwortung detaillierter Fragen über die Aktivitätsspezifität und Kinetik von Polynukleotid-Kiinasen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Forschung

Biochemie

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...