Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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हम डॉ एंड्रयू सिकेमा और एंड्रिया काइनस्की को इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; अमेरिका के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS; जिया ES103247 से आरईएस) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर; 146626 से एम.C.पी.

1. तैयारी
<ol><li>बफर और रिएजेंट तैयार करें।<ol>
<li>1 एम ट्रिज़ (पीएच = 8.0), 5 एम सोडियम क्लोराइड के 40 माइक्रोन, 2 एम मैग्नीशियम क्लोराइड के 2.5 माइक्रोन, 50% (v/v) ग्लिसरोल के 100 माइक्रोन और आरएनएसई-मुक्त पानी के 20 माइक्रोन के स...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

वर्णित फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स पर Grc3 PNK की काइनेज गतिविधि को मापने के लिए एक परख है। इस प्रोटोकॉल को रिएक्शन बफर और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट को अनुकूल बनाकर अन्य पीएन?...

पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) डीएनए की मरम्मत और राइबोसोम असेंबली1,2,,3,,4,5जैसे कई डीएनए और आरएनए प्रसंस्करण मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं।, ये मौलिक एंजाइम एक न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपी, अक्सर एटीपी) से टर्मिनल (गामा) मोनोफॉस्फेट के हस्तांतरण को न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट के 5 ' हाइड्रोक्सिल छोर में उत्प्रेरित करते हैं। सबसे अच्छी तरह से विशेषता वाले पीएनके में से एक बैक्टीरियोफेज टी 4 पीएनके है, जिसमें व्यापक सब्सट्रेट विशिष्टता है और आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा डीएनए या आरएनए सब्सट्रेट6,7,8,,,,,9,,11,12के 5 टर्मिनस पर रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबल को शामिल करने के लिए भारी उपयोग कियाजाताहै।, पीएनके एंजाइम का एक अन्य उदाहरण सीएलपी 1 है, जो यूकेरिया, यूबैक्टीरिया और आर्चिया में पाया जाता है, और कई आरएनए प्रसंस्करणमार्गों 4,13,,,14, 15,में फंसायाजाताहै।
ऐतिहासिक रूप से, अधिकांश परखते हैं कि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ गतिविधि को मापने रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबलिंग और बाद में ऑटोरेडियोग्राफी5,,16पर निर्भर हैं। हाल के वर्षों में पीएनके गतिविधि को मापने के लिए कई अतिरिक्त परख विकसित की गई हैं, जिनमें एकल अणु दृष्टिकोण, माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस, आणविक बीकन, साथ ही कोलोरिमेट्रिक और ल्यूमिनेसेंस आधारित परख17,18,,,19,,20, 21,,,2222शामिल हैं। जबकि इनमें से कई नए दृष्टिकोण बढ़ी हुई पहचान सीमा प्रदान करते हैं और रेडियोधर्मिता के उपयोग से बचते हैं, प्रत्येक में लागत, स्थिर राल पर निर्भरता और सब्सट्रेट विकल्प में सीमाएं जैसी कमियां हैं।
जीआरसी 3 एक पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ है जो प्री-रिबोसोमल आरएनए,2 ,3,23,के प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाताहै। Grc3 एंडोरिबो न्यूक्लियज़ लास1 के साथ एक अनिवार्य परिसर बनाता है, जो प्री-रिबोसोमल आरएनए3के आंतरिक लिखित स्पेसर 2 (ITS2) को क्लीव्स करता है। Las1 द्वारा ITS2 का क्लीवेज एक उत्पाद उत्पन्न करता है जो 5 ' हाइड्रोक्सिल को शरण देता है जिसे बाद में जीआरसी 3 किनेज़ 3 द्वारा फॉस्फोरिलेटेड कियाजाताहै। जीआरसी 3 की न्यूक्लियोटाइड और सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच करने के लिए, एक सस्ती परख जो विभिन्न ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के परीक्षण की अनुमति देती थी। इसलिए, फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले सब्सट्रेट्स का उपयोग करके एक पीएनके फॉस्फोरिलेशन परख विकसित की गई थी। इस परख का सफलतापूर्वक उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि जीआरसी 3 फॉस्फोरिल स्थानांतरण गतिविधि के लिए किसी भी एनटीपी का उपयोग कर सकता है, लेकिन एटीपी24के पक्ष में है। यह प्रोटोकॉल अपने प्री-रिबोसोमल आरएनए सब्सट्रेट (एससी-ITS2, टेबल 1)की आरएनए नकल पर Grc3 की PNK गतिविधि को मापने के लिए मूल परख को अनुकूलित करता है। इस फ्लोरेसेंस-आधारित दृष्टिकोण का एक चुनौतीपूर्ण पहलू फॉस्फोरिलेटेड और नॉनफोस्फोरिलेटेड सब्सट्रेट्स को प्रभावी ढंग से हल करने के लिए बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल पर निर्भरता है। प्रोटोकॉल कैसे इन बड़े जैल डालना है और आम नुकसान से बचने के लिए जब ऐसा करने पर विशिष्ट विवरण प्रदान करता है ।
आरएनए के साथ काम करने के लिए विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है क्योंकि यह गिरावट के लिए दृढ़ता से अतिसंवेदनशील होता है। राइबोन्यूलेज संदूषण को सीमित करने के लिए सरल निवारक कदम उठाए जा सकते हैं। एक अलग आरएनए वर्कस्टेशन जिसे आसानी से आरएनएएस अवरोधक युक्त सफाई एजेंट के साथ इलाज किया जा सकता है, अक्सर सहायक होता है। नमूनों को संभालते समय हमेशा दस्ताने पहनना और RNase-मुक्त प्रमाणित उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग आवश्यक है। क्योंकि पानी संदूषण का एक और आम स्रोत है, यह हौसले से शुद्ध पानी का उपयोग करें और एक ०.२२ μm फिल्टर का उपयोग कर सभी समाधान निष्फल करने के लिए सबसे अच्छा है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) एंजाइम हैं जो डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 5 हाइड्रोक्सिल छोर के फॉस्फोरिलेशन को उत्प्रेरित करते हैं। पीएनके की गतिविधि को प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष दृष्टिकोणों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत पीएनके गतिविधि को मापने के लिए एक प्रत्यक्ष, इन विट्रो दृष्टिकोण है जो फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट और पॉलीएक्रेलिमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर निर्भर करता है। यह दृष्टिकोण रेडियोलेबल सब्सट्रेट्स के उपयोग से बचते हुए फॉस्फोरिलेटेड उत्पादों का समाधान प्रदान करता है। प्रोटोकॉल विवरण कैसे फॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, तैयार करने और बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल चलाने के लिए, और प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा। इस परख का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हिस्सा बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल को डालना और चलाना है; इस प्रकार, सामान्य कठिनाइयों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण विवरण प्रदान किए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल को Grc3 के लिए अनुकूलित किया गया था, एक पीएनके जो अपने बाध्यकारी साथी, लास1 नाभिक के साथ एक अनिवार्य पूर्व-रिबोसोमल आरएनए प्रसंस्करण परिसर में इकट्ठा होता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य PNK एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस परख को प्रतिक्रिया के विभिन्न घटकों के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट, धातु आयन, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड।

Las1-Grc3 परिसर की एक निश्चित राशि के साथ एटीपी के एक टिटरेशन का एक सफल प्रतिनिधि डेनैचिंग जेल चित्र 1में दिखाया गया है। एंजाइम के अलावा SC-ITS2 आरएनए सब्सट्रेट के Las1-मध्यस्थता आरएनए दरार क...

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

यह प्रोटोकॉल छोटे डीएनए और आरएनए सब्सट्रेट्स पर पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) की किनेज़ गतिविधि को मापने के लिए एक गैर-रेडिक परख का वर्णन करता है।

छोटे न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के पॉलीन्यूक्लियोटाइड फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए गैर-रेड्रियक परख

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

यह विधि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ के रूप में जाने जाने वाले एंजाइमों के एक विशेष वर्ग द्वारा डीएनए या आरएनए अणुओं के पांच-प्राइम एंड के फॉस्फोरिलेशन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब दे सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि डीएनए और आरएनए सब्सट्रेट्स में बहुत छोटे बदलावों का पता लगाने का संकल्प है। आरएनए एंजाइम किनेज़ प्रतिक्रियाओं को तैयार करके शुरू करें।प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 500 नैनोमोलर आरएनए सब्सट्रेट के एक माइक्रोलीटर को मिलाएं। 130 नैनोमोलर के 8.3 माइक्रोलीटर पिछले एक, जीआरसी तीन और पांच मिलीमोलर ईडीटीए के 0.2 माइक्रोलीटर। हीट ब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।फिर एक आरएनए एंजाइम मिश्रण के साथ एकाग्रता श्रृंखला से एक एटीपी सब स्टॉक के 0.5 माइक्रोलीटर मिश्रण और गर्मी ब्लॉक पर प्रतिक्रिया जगह है। प्रतिक्रियाओं को मिलाने और उन्हें दस सेकंड अंतराल पर हीट ब्लॉक पर रखना जारी रखें। हीट ब्लॉक पर 60 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, यूरिया लोडिंग डाई के 10 माइक्रोलीटर के साथ स्पाइकिंग करके प्रत्येक प्रतिक्रिया को बुझाएं।तुरंत डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करें या प्रतिक्रियाओं को बाद की तारीख में विश्लेषण करने के लिए नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 15% एक्रिलैमाइड जेल समाधान तैयार करने के लिए, 22.5 मिलीलीटर पूर्व-मिश्रित 40% 29 को एक एक्रिलामाइड/बीआईएस एक्रिलैमाइड समाधान में मिलाएं। दस एक्स TBE के छह मिलीलीटर ।28.8 ग्राम यूरिया। और RNase ५९ मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए मुफ्त पानी । फिर धीरे-धीरे समाधान हिलाएं।घोल को माइक्रोवेव में 20 सेकंड के लिए गर्म करें। इसे हिलाओ और तुरंत इसे एक और 20 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में वापस । धीरे-धीरे घोल को तब तक हिलाएं जब तक यूरिया पूरी तरह से घुल न जाए।कांच बीकर को उथले पानी के स्नान में रखें, जिसमें पांच मिनट के लिए ठंडे पानी होते हैं, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि ग्लास बीकर के आसपास के ठंडे पानी का स्तर ग्लास बीकर के अंदर समाधान के स्तर से ऊपर है। जब समाधान ठंडा होता है, तो कणों और सूक्ष्म हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 0.2 दो माइक्रोमीटर डिस्पोजेबल निस्पंदन इकाई के साथ इसे फ़िल्टर और डी-गैस करें। साबुन और पानी के साथ एक छोटी और लंबी ग्लास प्लेट धोएं फिर प्रत्येक प्लेट को 95% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और किसी भी नमी को हटाने के लिए ग्लास को पोंछ दें।एक बॉक्स के ऊपर रखकर बेंच टॉप से लंबी प्लेट को ऊंचा करें। फिर प्लेट के लंबे किनारों के साथ 0.4 मिलीमीटर स्पेसर की स्थिति रखें। लंबी प्लेट के शीर्ष पर छोटी प्लेट बिछाएं, जिससे यह सुनिश्चित हो जाए कि छोटी प्लेट, लंबी प्लेट और स्पेसर्स के किनारों को गठबंधन किया जाए।फिर तीन समान रूप से दूरी धातु क्लैंप के साथ प्रत्येक पक्ष को क्लैंप करें। एक्रिलैमाइड सॉल्यूशन में टेमीड के 24 माइक्रोलीटर डालकर मिला लें। फिर 10% एपीएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और तुरंत ग्लास प्लेटों के बीच समाधान डालें।ग्लास प्लेट सैंडविच के बीच एक्रिलैमाइड समाधान डालना वास्तव में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हवा के बुलबुले से बचने के लिए, जब आप अपना समाधान डाल रहे हों तो ग्लास प्लेट सैंडविच को टैप करें। ध्यान से ग्लास प्लेट सैंडविच के शीर्ष पर एक साफ 32-अच्छी तरह से कंघी जोड़ें।और एक्रिलैमाइड को 30 मिनट के लिए बहुलक होने दें। जेल चलाने के लिए, हीट ब्लॉक को 75 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। धातु क्लैंप निकालें।और ग्लास प्लेट सैंडविच को अच्छी तरह धोकर सुखा लें। प्लेट सैंडविच और जेल उपकरण को आगे की ओर सामना करने वाली छोटी प्लेट के साथ रखें और 10 एक्स टीबीई के 100 मिलीलीटर को 1.9 लीटर आरएनएसई मुक्त पानी के साथ जोड़कर 0.5 X TBE रनिंग बफर तैयार करें। उपकरण के ऊपरी और निचले कक्षों में चल रहे बफर के 600 मिलीलीटर जोड़ें।धीरे-धीरे जेल से कंघी निकालें और कुओं को सिरिंज से अच्छी तरह से कुल्ला करें। 30 मिनट के लिए 50 वाट पर जेल को प्री-चलाएं। इसके बाद फिर से कुएं को खंगाल डाला।शमन प्रतिक्रियाओं को स्पिन करने के बाद उन्हें तीन मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पल्स स्पिन को दोहराएं और तुरंत जेल पर प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोलीटर लोड करें। इसके बाद 50 वाट पर तीन घंटे तक जेल चलाएं।जब रन समाप्त हो गया है, बिजली की आपूर्ति बंद करो और उपकरण के ऊपरी कक्ष नाली । कांच की प्लेट सैंडविच के बाहरी हिस्से को धोकर सुखा लें। फिर इसे पन्नी से ढक कर इमेजिंग के लिए लेजर स्कैनर में ट्रांसफर कर दें।लेजर स्कैनर के मंच पर ग्लास प्लेट सैंडविच माउंट। जेल के लिए वांछित मंजिल के लिए उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें और छवि करें। यहां दिखाया गया है कि पिछले एक जीआरसी तीन परिसर की एक निश्चित राशि के साथ एटीपी के एक टिटरेशन का एक प्रतिनिधि सफल डेनैचिंग जेल है।एंजाइम के अलावा पिछले एक मध्यस्थता आरएनए दरार के परिणामस्वरूप सैकरोमाइसिस सेरेविसीए इट्स दो आरएनए सब्सट्रेट, जिससे एक परिभाषित आरएनए टुकड़ा हो गया। एटीपी के अलावा, C2 आरएनए टुकड़ा GrC3 PNK द्वारा फॉस्फोरिलेटेड था । C2 आरएनए टुकड़े के फॉस्फोरिलेशन की कल्पना करने के लिए, एटीपी एकाग्रता के खिलाफ अनफोस्फोरिलेटेड और फॉस्फोरिलेटेड सी 2 आरएनए की सापेक्ष मात्रा की साजिश रची गई थी।हमारे प्रतिनिधि असफल डेनैचिंग जेल यहां दिखाया गया है । 21 न्यूक्लियोटाइड आरएनए सब्सट्रेट में गिरावट वाले उत्पाद शामिल थे, जो फॉस्फोरिलेटेड उत्पाद के साथ छा गए और फॉस्फोरिलेशन को सटीक रूप से बताना असंभव बना दिया। इसके विपरीत, सबसे कम आरएनए क्षरण उत्पाद का सफलतापूर्वक विश्लेषण किया जा सकता है क्योंकि जेल के इस क्षेत्र में कोई अतिरिक्त आरएनए प्रजातियां शामिल नहीं थीं जो इसके फॉस्फोरिलेटेड समकक्ष के सटीक मात्राकरण में रुकावट डालती थीं।इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि आपके नमूने को लोड करने के लिए जेल के कुओं को कुल्ला करना है। इस प्रक्रिया के बाद, एक आरएनए कारोबार प्रयोग किया जा सकता है । आरएनए क्षरण की दरों को मापने के लिए, फॉस्फोरिलेशन अक्सर आरएनए क्षरण की शुरुआत का संकेत देती है।यह तकनीक पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेस की गतिविधियों विशिष्टता और काइनेटिक्स के बारे में विस्तृत सवालों का जवाब देने का मार्ग प्रशस्त करती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

फास्फोरिलेशन साइट निर्धारण के लिए ओलिगोपेप्टाइड प्रतियोगिता परख

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस वैश्विक स्थानीयकृत अनुवाद मापने के लिए

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

फास्फारिलीकरण के लिए परख और कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में ताऊ प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ बाध्यकारी Microtubule

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin के आश्रित कळेनासे 1 विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान एक इन विट्रो कळेनासे परख

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

एक न्यूक्लियोटाइड विस्तार और मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग कर ठीक करना और डीएनए मरंमत परख

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

दोहरी डीएनए शासकों एकल-न्यूक्लिओटाइड संकल्प के साथ रिबोसोम स्थानांतरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में परिवर्तन को मापने के लिए एक एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करना

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

वास्तविक समय में बरकरार, कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापना

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...