Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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Ringraziamo il Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Intramural Research Program degli Stati Uniti; Istituto Nazionale delle Scienze della Salute Ambientale degli Stati Uniti (NIEHS; ES103247 a R.E.S) e i Canadian Institutes of Health Research (CIHR; da 146626 a M.C.P).

1. Preparazione
<ol><li>Preparare buffer e reagenti.<ol>
<li>Fare 1x Buffer di reazione combinando 20 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 40 L di cloruro di sodio 5 M, 2,5 L di 2 M di cloruro di magnesio, 100 L del 50% (v/v) glicerolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 1 mL.</li>
		<li>Fare il colorante di carico dell'urea combinando 4,8 g di urea, 200 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 20 L di 0,5 M EDTA (pH - 8,0), 0,5 mL dell'1% (w/v) di blu bromofenolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 10 mL...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. 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R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. 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M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Descritto è un saggio per misurare l'attività della chinasi di Grc3 PNK su substrati nucleotidi etichettati fluorescentemente. Questo protocollo può essere applicato per caratterizzare altri enzimi PNK adattando il buffer di reazione e il substrato di oligonucleotide. Ad esempio, il protocollo richiede una quantità di traccia di EDTA. L'aggiunta di EDTA è vantaggiosa per due motivi: in primo luogo, questo approccio favorisce Grc3 legato al magnesio impedendo all'enzima di legarsi alla traccia di tracce di metalli co...

Le chinasi polinucleotide (PNK) svolgono un ruolo fondamentale in molti percorsi di elaborazione del DNA e dell'RNA, come la riparazione del DNA e l'assemblaggio delribosoide 1,2,3,4,5. Questi enzimi fondamentali catalizzano il trasferimento del monofosfato terminale (gamma) da un triphosfato nucleoside (NTP, il più delle volte ATP) all'estremità idrossile da 5' di un substrato nucleotide. Uno dei PNK più caratterizzati è il batteriofago T4 PNK, che ha un'ampia specificità del substrato ed è fortemente utilizzato dai laboratori di biologia molecolare per incorporare etichette di isotopi radioattivi sul 5 capolinea di un sottostrato DNA o RNA6,7,8,9,10,11,12. Un altro esempio di enzima PNK è CLP1, che si trova in Eukarya, Eubacteria e Archaea, ed è implicato in diversi percorsi di elaborazione dell'RNA4,13,14,15.
Storicamente, la maggior parte dei saggi che misurano l'attività della chinasi polinucleotide dipendono dall'etichettatura degli isotopi radioattivi e dalla successiva autoradiografia5,16. Negli ultimi anni sono stati sviluppati una serie di analisi aggiuntive per misurare l'attività PNK, tra cui approcci a singola molecola, elettroforesi microchip, fari molecolari, così come saggi colorimetrici e a base di luminescenza17,18,19,20,21,22. Mentre molti di questi nuovi approcci forniscono limiti di rilevamento avanzati ed evitano l'uso della radioattività, ognuno presenta svantaggi, come il costo, la dipendenza dalla resina immobilizzata e le limitazioni nella scelta del substrato.
Grc3 è una chinasi polinucleotide che svolge un ruolo fondamentale nella lavorazione dell'RNA pre-ribosomico2,3,23. Grc3 forma un complesso obbligato con l'endoribonuclease Las1, che fasi la Spacer 2 (ITS2) interna trascritta dell'RNA pre-ribosomico3. Cleavage dell'ITS2 di Las1 genera un prodotto che ospita un idrossilo da 5' che viene successivamente fosforilato dalla chinasi Grc33. Per studiare la specificità nucleotide e substrato di Grc3, è stato necessario un saggio economico che permettesse di testare diversi substrati di oligonucleotide. Pertanto, è stato sviluppato un saggio di fosforilazione PNK utilizzando substrati con etichetta fluorescente. Questo saggio è stato utilizzato con successo per determinare che Grc3 può utilizzare qualsiasi NTP per l'attività di trasferimento del fosforile, ma favorisce ATP24. Questo protocollo adatta il saggio originale per misurare l'attività PNK di Grc3 su un RNA che imita il suo substrato di RNA pre-ribosomico (SC-ITS2, Tabella 1). Un aspetto impegnativo di questo approccio basato sulla fluorescenza è la dipendenza da grandi gel poliacrilammide per risolvere efficacemente i substrati fosforilati e non fosforilati. Il protocollo fornisce dettagli specifici su come versare questi grandi gel ed evitare insidie comuni quando si fa.
Lavorare con l'RNA richiede particolare attenzione perché è fortemente suscettibile alla degradazione. Ci sono semplici misure preventive che si possono adottare per limitare la contaminazione da ribonucleasi. Una postazione di lavoro RNA separata che può essere facilmente trattata con un agente di pulizia contenente inibitori RNase è spesso utile. È necessario indossare sempre i guanti durante la manipolazione dei campioni e l'uso di consumabili certificati senza RNase. Poiché l'acqua è un'altra fonte comune di contaminazione, è meglio usare acqua appena purificata e sterilizzare tutte le soluzioni utilizzando un filtro da 0,22 m.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Le chinasi polinucleotide (PNK) sono enzimi che catalizzare la fosforilazione dell'estremità idrossile 5' del DNA e dell'RNA oligonucleotidi. L'attività dei PNK può essere quantificata utilizzando approcci diretti o indiretti. Qui è presentato un approccio diretto in vitro per misurare l'attività PNK che si basa su un substrato oligonucleotide etichettato fluorescente e elettroforesi gel poliacrilammide. Questo approccio fornisce la risoluzione dei prodotti fosforilati evitando l'uso di substrati con etichettatura radio. Il protocollo descrive in dettaglio come impostare la reazione di fosforilazione, preparare ed eseguire grandi gel di poliacrilammide e quantificare i prodotti di reazione. La parte più tecnicamente impegnativa di questo saggio è versare ed eseguire i grandi gel di poliacrilammide; vengono quindi forniti dettagli importanti per superare le difficoltà comuni. Questo protocollo è stato ottimizzato per Grc3, un PNK che si assembla in un complesso di elaborazione dell'RNA pre-ribosomico obbligatorio con il suo partner vincolante, il nucleasi Las1. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare l'attività di altri enzimi PNK. Inoltre, questo saggio può anche essere modificato per determinare gli effetti di diversi componenti della reazione, come il triphosfato nucleoside, gli ioni metallici e gli oligonucleotidi.

Nella Figura 1è illustrato un gel rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa di complesso Las1-Grc3 . L'aggiunta dell'enzima ha portato alla scissione dell'RNA mediata da Las1 del substrato di RNA SC-ITS2, portando a un frammento di RNA definito (5-OH C2 RNA). Dopo l'aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Nei gel denaturing l'RNA fosforilato migra più velocemente della sua co...

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave sulla fosforilazione dell'estremità a cinque primi del DNA o delle molecole di RNA da una speciale classe di enzimi noti come polinucleotide chinasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ha la risoluzione di rilevare cambiamenti molto piccoli nei substrati di DNA e RNA. Inizia preparando le reazioni dell'enzima RNA chinasi.Per ogni reazione, combinare un microlitro di 500 substrati di RNA nanomolare. 8,3 microlitri di 130 nanomolari l'ultimo, GRC tre e 0,2 microlitri di edta millimolare. Impostare il blocco di calore su 37 gradi Celsius.Quindi mescolare 0,5 microlitri di un sotto stock ATP della serie di concentrazione con una miscela enzimatica di RNA e posizionare la reazione sul blocco termico. Continuare a mescolare le reazioni e posizionarle sul blocco termico a intervalli di dieci secondi. Dopo un'incubazione di 60 minuti sul blocco termico, dissetare ogni reazione spiking con 10 microlitri di colorante di carico dell'urea.Eseguire immediatamente l'analisi a valle o memorizzare le reazioni a -20 gradi Celsius da analizzare in un secondo momento. Per preparare una soluzione di gel di acrilammide denaturante al 15%, combinare 22,5 millilitri di pre-miscelato 40%29 con una soluzione di acrilammide/bis acrilammide. Sei millilitri di dieci x TBE.28,8 grammi di urea. E rnasi acqua libera ad un volume totale di 59 millilitri. Quindi mescolare delicatamente la soluzione.Riscaldare la soluzione nel microonde per 20 secondi. Mescolarlo e restituirlo immediatamente al microonde per altri 20 secondi. Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando l'urea non è completamente sciolta.Posizionare il becher di vetro in un bagno d'acqua poco profondo, contenente acqua fredda per cinque minuti, assicurandosi che il livello di acqua fredda che circonda il becher di vetro sia superiore al livello della soluzione all'interno del becher di vetro. Quando la soluzione è fredda, filtrarla e de-gasarla con un'unità di filtrazione monouso da 0,2 micrometri per rimuovere particolato e microscopiche bolle d'aria. Lavare una lastra di vetro corta e lunga con acqua e sapone, quindi spruzzare ogni piastra con etanolo al 95% e pulire il vetro per rimuovere l'umidità.Eleva la piastra lunga dal piano del banco posizionandolo sopra una scatola. Quindi posizionare distanziati di 0,4 millimetri lungo i lunghi bordi della piastra. Posare la piastra corta sopra la piastra lunga, assicurandosi che i bordi della piastra corta, della piastra lunga e dei distanziale siano allineati.Quindi bloccare ogni lato con tre morsetti metallici distanziati uniformemente. Aggiungere 24 microlitri di TEMED alla soluzione di acrilammide e mescolarlo. Quindi aggiungere 600 microlitri del 10%APS e versare immediatamente la soluzione tra le lastre di vetro.Versare la soluzione di acrilammide tra il sandwich di piastra di vetro può essere davvero impegnativo. Per evitare bolle d'aria, toccare il sandwich di piastra di vetro mentre si versa la soluzione. Aggiungere con cura un pettine pulito da 32 porsi sulla parte superiore del sandwich della piastra di vetro.E lasciare che l'acrilammide polimerizzi per 30 minuti. Per eseguire il gel, impostare il blocco di calore su 75 gradi Celsius. Rimuovere i morsetti metallici.E lavare e asciugare accuratamente il sandwich della piastra di vetro. Posizionare il sandwich piastra e l'apparato gel con la piastra corta rivolta in avanti e preparare il tampone di funzionamento 0,5 X TBE combinando 100 millilitri di 10 X TBE con 1,9 litri di acqua libera RNasi. Aggiungere 600 millilitri del tampone di corsa alle camere superiore e inferiore dell'apparecchio.Rimuovere delicatamente il pettine dal gel e sciacquare accuratamente i pozzi con una siringa. Pre-eseguire il gel a 50 Watt per 30 minuti. Quindi risciacquare di nuovo i pozzi.Post spin le reazioni di tempra e incubarle a 75 gradi Celsius per tre minuti. Ripetere lo spin dell'impulso e caricare immediatamente 10 microlitri di ogni campione sul gel. Quindi eseguire il gel per tre ore a 50 Watt.Al termine della corsa, spegnere l'alimentatore e scaricare la camera superiore dell'apparecchio. Lavare e asciugare il lato esterno del sandwich della piastra di vetro. Quindi coprirlo con un foglio e trasferirlo su uno scanner laser per l'imaging.Montare il sandwich della piastra di vetro sul palco dello scanner laser. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per il pavimento desiderato e l'immagine del gel. Qui è mostrato un gel di denaturazione rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa dell'ultimo complesso GRC three.L'aggiunta di enzima ha portato all'ultima scissione mediata dell'RNA del Saccharomyces cerevisiae ITS due substrati di RNA, portando a un frammento di RNA definito. Dopo l'aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da GrC3 PNK. Per visualizzare la fosforilazione del frammento di RNA C2, la quantità relativa di RNA C2 non fosforilato e fosforilato è stata tracciata rispetto alla concentrazione di ATP.Il nostro gel di denaturazione rappresentativo non riuscito è mostrato qui. Il substrato di RNA nucleotidico 21 conteneva prodotti di degradazione, che si sovrapponevano al prodotto fosforilato e rendevano impossibile quantificare accuratamente la fosforilazione. Al contrario, il prodotto di degradazione dell'RNA più breve poteva essere analizzato con successo perché quest'area del gel non conteneva altre specie di RNA che ostacolavano una quantificazione accurata della sua controparte fosforilata.La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo è sciacquare i pozzi del gel per garantire un caricamento uniforme del campione. Seguendo questa procedura, potrebbe essere eseguito un esperimento di turnover dell'RNA. Per misurare i tassi di degradazione dell'RNA, la fosforilazione spesso segnala l'inizio della degradazione dell'RNA.Questa tecnica apre la strada per rispondere a domande dettagliate sulla specificità delle attività e sulla cinetica delle chinasi polinucleotidiche.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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