Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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アンドリュー・シッケマ博士とアンドレア・カミンスキー博士の批判的な原稿の読み方に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所の壁内研究プログラムによって支援されました。米国環境衛生研究所(NIEHS;ZIA ES103247からR.E.S)とカナダ保健研究所(CIHR;146626からM.C.P)へ。

1. 準備
<ol><li>バッファーと試薬を準備します。<ol>
<li>1 Mトリス20μL(pH = 8.0)、5M塩化ナトリウム40μL、2.5μLの2M塩化マグネシウム、50%(v/v)グリセロールの100μL、およびRNaseフリーウォーターを組み合わせて1mLの総体積に達することにより、1x反応バッファーを作ります。</li>
		<li>尿素4.8g、1Mトリス200μL(pH = 8.0)、0.5M EDTA(pH = 8.0)の20μL、1%(w/v)ブロモフェノールブルーの0.5mL、およびRNaseフリー水を組?...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. 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M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

説明は、蛍光標識ヌクレオチド基質に対するGrc3 PNKのキナーゼ活性を測定するアッセイである。このプロトコルは、反応バッファーとオリゴヌクレオチド基質を適応させることによって他の PNK 酵素を特徴付けるために適用できます。たとえば、プロトコルは EDTA のトレース量を必要とします。EDTAの添加は2つの理由で有益である:まず、このアプローチは、混合物中の微量の汚染金属に酵素が...

ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)は、DNA修復およびリボソームアセンブリ1、2、3、4、52,3などの多くのDNAおよびRNA処理経路において重要な役割,4を5果たす。1これらの基本的な酵素は、ヌクレオシド三リン酸(NTP、最も頻繁にATP)からヌクレオ基質の5'ヒドロキシル末端への末端(γ)一リン酸の転写を触媒する。最もよく特徴づけられるPNKsの1つはバクテリオファージT4 PNKであり、広範な基質特異性を有し、DNAまたはRNA基板の5末端に放射性同位体標識を組み込むための分子生物学研究室によって多く利用されている676、7、8、9、10、11、128,9,10,11,12である。,PNK酵素の別の例は、エウカヤ、ユースバクテリア、および古細菌に見られるCLP1であり、いくつかのRNA処理経路44、13、14、1513,14,15に関与している。
歴史的に、ポリヌクレオチドキナーゼ活性を測定するほとんどのアッセイは、放射性同位体標識とそれに続くオートラジオグラフィー55,1616に依存する。,近年では、単一分子アプローチ、マイクロチップ電気泳動、分子ビーコン、および,17、18、19、20、21、22の着色および発光ベースアッセイを含む、PNK活性を測定17,18,19するための追加アッセイが数多く開発されている。21,2220これらの新しいアプローチの多くは、検出限界を強化し、放射能の使用を回避しますが、コスト、固定樹脂への依存、および基板選択の制限などの欠点があります。
Grc3は、リボソーム前,RNA2,3,23,3の処理において極めて重要な役割を果たすポリヌクレオチドキナーゼである。23Grc3は、エンドリボヌクレアーゼLas1と共に、リボソームRNA3の内部転写スペーサー2(ITS2)を切断する義務複合体を形成する。Las1によるITS2の切断は、その後Grc3キナーゼ3によってリン酸化される5'ヒドロキシルを収容する製品を生成する。Grc3のヌクレオチドおよび基質特異性を調べるには、異なるオリゴヌクレオチド基質の検査を可能とする安価なアッセイが必要であった。そこで、蛍光標識基質を用いたPNKリン酸化アッセイが開発された。このアッセイは、Grc3がリン酸化伝達活動のために任意のNTPを利用できることを決定するためにうまく使用されたが、ATP24を支持する。このプロトコルは、元のアッセイを適応させ、その前リボソームRNA基質のRNA模倣物に対するGrc3のPNK活性を測定する(SC-ITS2、表1)。この蛍光ベースのアプローチの挑戦的な側面の1つは、リン酸化および非リン酸化基質を効果的に解決するための大きなポリアクリルアミドゲルへの依存である。プロトコルは、これらの大きなゲルを注ぐ方法についての具体的な詳細を提供し、そうするときに一般的な落とし穴を避ける。
RNAを使用する場合は、分解の影響を強く受けやすいため、特に注意が必要です。リボヌクレアーゼ汚染を制限するために取ることができる簡単な予防ステップがあります。RNase阻害剤含有洗浄剤で容易に処理できる別のRNAワークステーションは、しばしば有用である。試料の取り扱い時には常に手袋を着用し、RNaseフリーの認定消耗品を使用する必要があります。水は汚染の別の一般的な原因であるため、精製された水を使用し、0.22 μmのフィルターを使用してすべての溶液を殺菌するのが最善です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)は、DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシル末端のリン酸化を触媒する酵素である。PNK のアクティビティは、直接的または間接的なアプローチを使用して定量化できます。ここで提示されるPNK活性を測定するための直接的なインビトロアプローチは、蛍光標識オリゴヌクレオチド基質およびポリアクリルアミドゲル電気泳動に依存する。このアプローチは、放射性標識基材の使用を避けながら、リン酸化産物の分解能を提供します。プロトコルは、リン酸化反応を設定する方法を詳述し、大規模なポリアクリルアミドゲルを調製して実行し、反応生成物を定量化します。このアッセイの最も技術的に挑戦的な部分は、大きなポリアクリルアミドゲルを注ぎ、実行しています。したがって、共通の困難を克服するための重要な詳細が提供されます。このプロトコルは、結合パートナーであるLas1ヌクレアーゼと共に、義務的なプリリボソームRNA処理複合体に組み立てるPNKであるGrc3に最適化されました。しかし、このプロトコルは、他のPNK酵素の活性を測定するために適応することができる。また、このアッセイは、ヌクレオシド三リン酸、金属イオン、オリゴヌクレオチドなどの反応の異なる成分の影響を決定するように改変することもできる。

一定量の Las1-Grc3 複合体を有する ATP の滴定の代表変性ゲルを図 1に示します。酵素の付加は、SC-ITS2 RNA基質のLas1媒介RNA切断をもたらし、定義されたRNA断片(5-OH C2 RNA)につながった。ATPを添加すると、C2 RNA断片をGrc3 PNK(5-P C2 RNA)によりリン酸化した。変性ゲルでは、リン酸化RNAは、その非リン酸化されたRNAよりも速く移動します。 図...

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

このプロトコルは、小さなDNAおよびRNA基質上のポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)のキナーゼ活性を測定するための非放射性アッセイを記述する。

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

この方法は、ポリヌクレオチドキナーゼとして知られている酵素の特別なクラスによるDNAまたはRNA分子の5素端のリン酸化に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、DNAおよびRNA基質の非常に小さな変化を検出する分解能を有することである。まず、RNA酵素キナーゼ反応を調製します。反応ごとに、500ナノモルRNA基質の1マイクロリットルを組み合わせます。8.3マイクロリットルの130ナノモル最後の1、GRC 3と5ミリモルEDTAの0.2マイクロリットル。ヒートブロックを摂氏37度に設定します。その後、濃度系列からATPサブストックの0.5マイクロリットルを1つのRNA酵素混合物と混合し、熱ブロックに反応を置きます。反応を混合し続け、10秒間隔でヒートブロックに置きます。ヒートブロックに60分間インキュベーションした後、10マイクロリットルの尿素負荷染料でスパイクして各反応を焼き付けます。直ちに下流解析を行うか、後日分析するマイナス20°Cで反応を保存します。15%変性アクリルアミドゲル溶液を調製するには、22.5ミリリットルのプレコンプド40%29をアクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液1個に組み合わせます。10 x TBEの6ミリリットル。尿素の28.8グラム。そして、RNaseは59ミリリットルの総容量に水を解放する。その後、溶液を軽くかき混ぜます。電子レンジで溶液を20秒間加熱します。かき混ぜて、すぐにさらに20秒間電子レンジに戻します。尿素が完全に溶解するまで溶液を軽くかき混ぜます。冷たい水を含む浅い水浴にガラスビーカーを入れ、ガラスビーカーを取り巻く冷たい水のレベルがガラスビーカー内の溶液のレベルを上回っていることを確認します。溶液が冷たい場合は、0.2マイクロメートルの使い捨て濾過ユニットでフィルター処理し、ガスを除去し、微粒子や微視的な気泡を除去します。短くて長いガラス板を石鹸と水で洗い、各プレートに95%エタノールを吹き付け、ガラスを拭いて水分を取り除きます。ボックスの上に置くことによってベンチトップから長いプレートを高めます。次に、プレートの長いエッジに沿って 0.4 ミリメートルスペーサーを配置します。長いプレートの上に短いプレートを置き、短いプレート、長いプレート、スペーサーのエッジが揃っていることを確認します。次に、各側に3つの均等な間隔の金属クランプをクランプします。24マイクロリットルのTEMEDをアクリルアミド溶液に加え、混ぜます。その後、10%APSの600マイクロリットルを加え、すぐにガラスプレートの間に溶液を注ぎます。ガラス板サンドイッチの間にアクリルアミド溶液を注ぐことは本当に困難なことができます。気泡を避けるために、溶液を注いでいる間にガラス板サンドイッチをタップします。ガラス板サンドイッチの上部に清潔な32ウェルコームを慎重に追加します。そして、アクリルアミドを30分間重合させる。ゲルを実行するには、ヒートブロックを摂氏75度に設定します。金属クランプを取り外します。そして、ガラス板サンドイッチを十分に洗って乾燥させます。プレートサンドイッチとゲル装置を前向きのショートプレートに置き、10 X TBEの100ミリリットルとRNaseフリー水1.9リットルを組み合わせて0.5 X TBEランニングバッファを調製します。装置の上下の部屋にランニングバッファーの600ミリリットルを加えます。ジェルからくしをそっと取り出し、シリンジで井戸を十分に洗いすめます。ゲルを50ワットで30分間事前に実行します。その後、もう一度井戸をすすいします。ポストはクエンチ反応を回転させ、摂氏75度で3分間インキュベートします。パルス回転を繰り返し、すぐに各サンプルの10マイクロリットルをゲルにロードします。その後、50ワットで3時間ゲルを実行します。走行が終了したら、電源をオフにして装置の上部チャンバーを排出します。ガラス板サンドイッチの外側を洗って乾かします。その後、ホイルでそれをカバーし、イメージングのためのレーザースキャナに転送します。ガラス板サンドイッチをレーザースキャナーのステージに取り付けます。希望の床の励起波長と発光波長を設定し、ゲルを画像化します。ここに示されているのは、最後の1つのGRC3複合体の固定量を有するATPの滴定の代表的な成功した変性ゲルである。酵素の付加は、サッカロミセスセレビシエITS 2 RNA基質の最後の1つの媒介RNA切断をもたらし、定義されたRNA断片をもたらした。ATPを添加すると、C2 RNA断片をGrC3 PNKによりリン酸化した。C2 RNA断片のリン酸化を可視化するために、非リン酸化およびリン酸化されたC2RNAの相対量をATP濃度に対してプロットした。私たちの代表的な失敗した変性ゲルはここに示されています。21塩基RNA基質には分解物が含まれており、リン酸化産物と重なり合い、リン酸化を正確に定量することが不可能となった。対照的に、ゲルのこの領域には、リン酸化された相手の正確な定量化を妨げる追加のRNA種が含まれていないため、最短のRNA分解産物の分析に成功しました。このプロトコルを試す際に覚えておかねばなることは、サンプルのローディングを確実にするためにゲルのウェルをすすいでください。この手順に従って、RNAターンオーバー実験を行うことができる。RNA分解率を測定するために、リン酸化はしばしばRNA分解のシグナル開始を示します。この技術は、ポリヌクレオチドキナーゼの活動特異性および運動に関する詳細な質問に答える道を開きます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

単一ヌクレオチド分解能を持つリボソーム転移のメカニズムを研究するデュアルDNA定規

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...