Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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앤드류 시케마 박사와 안드레아 카민스키 박사에게 이 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 보건 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다; 미국 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS; ZIA ES103247 - R.E.S) 및 캐나다 보건 연구소 (CIHR; 146626 ~ M.C.P).

1. 준비
<ol><li>버퍼 및 시약을 준비합니다.<ol>
<li>1M 트리스(pH = 8.0), 염화나트륨 40μL, 염화나트륨 2M의 2.5 μL, 염화마그네슘 2M의 2.5 μL, 50%(v/v) 글리세롤 100μL, RNase 없는 물을 결합하여 1mL의 총 부피량에 도달하여 1x 반응 버퍼를 만듭니다.</li>
		<li>4.8g의 우레아 로딩 염료, 1M 트리의 200 μL(pH = 8.0), 0.5M EDTA(pH = 8.0), 0.5mL의 0.5mL(pH = 8.0), 1%(w/v) 브로모페놀 블루, RNase 프리 워터를 결합하여 총 10mL의 부피량?...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

설명된 것은 형광표지 뉴클레오티드 기판에 Grc3 PNK의 키나아제 활성을 측정하는 분석이다. 이 프로토콜은 반응 버퍼 및 올리고뉴클레오티드 기판을 적응시킴으로써 다른 PNK 효소를 특성화하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어 프로토콜은 미량의 EDTA를 요구합니다. EDTA의 첨가는 두 가지 이유로 유익합니다: 첫째, 이 접근법은 효소가 혼합물에 있는 오염 금속의 미량에 결합하는 것을 방지해서 마?...

폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)는 DNA 수리 및 리보솜 어셈블리1,,2,,3,,4,,5와같은 많은 DNA 및 RNA 처리 경로에서 중요한 역할을 한다. 이러한 근본적인 효소는 뉴클레오시드 삼위산염(NTP, 가장 자주 ATP)에서 뉴클레오티드 기판의 5' 하이드록실 끝으로 의 단말(감마) 단포산염의 전달을 촉매한다. 가장 잘 특징적인 PNK 중 하나는 광범위한 기판 특이성을,가지며 DNA 또는 RNA 기판,6,,7, 7,8,9,10,,911,,12의5종에 방사성 동위원소 라벨을 통합하기 위한 분자 생물학 실험실에서 크게 활용되는 박테리오파지 T4 PNK이다. PNK 효소의 또 다른 예는 EUKarya, 유박테리아 및 고고학에서 발견되는 CLP1이며, 여러 RNA 처리 경로4,,,13,14,,15에연루된다.
역사적으로, 폴리뉴클레오티드 키나아제 활성을 측정하는 대부분의 분석체는 방사성 동위원소 라벨링 및 후속 사인 방사선 촬영5,,16에의존한다. 최근에는 단일 분자 접근법, 마이크로칩 전기포전, 분자 비콘, 색색 및 발광 계분석17,,18,,19,,20,,21,,22를포함한 PNK 활성을 측정하기 위해 다수의 추가 분석이 개발되었다. 이러한 새로운 접근 방식의 대부분은 향상된 검출 한계를 제공하고 방사능 사용을 피할 수 있지만, 각각은 비용, 고정 수지에 대한 의존, 기판 선택의 한계와 같은 단점이 있습니다.
Grc3은 프리 리보소말 RNA,2,3,323의처리에 중추적인 역할을 하는 폴리뉴클레오티드 키나아제이다. Grc3은 사전 리보소말 RNA3의내부 전사 스페이서 2 (ITS2)를 갈라엔엔토리코나클레스 Las1을 갖춘 의무 복합체를 형성한다. ITS2의 골짜기는 Grc3 키나아제3에의해 인광되는 5' 하이드록실을 수용하는 제품을 생성한다. Grc3의 뉴클레오티드 및 기판 특이성을 조사하기 위해서는 상이한 올리고뉴클레오티드 기판의 테스트를 허용한 저렴한 분석이 필요했습니다. 따라서 형광 표지기기판을 이용한 PNK 인산화 분석이 개발되었다. 이 분석체는 Grc3이 인산화균 전송 활동에 대한 NTP를 활용할 수 있지만 ATP24를선호한다는 것을 확인하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 프로토콜은 본래 분석체를 조정하여 그 전 리보소말 RNA 기판(SC-ITS2, 표 1)의RNA 모방에 대한 Grc3의 PNK 활성을 측정한다. 이 형광 기반 접근의 한 가지 도전적인 측면은 효과적으로 인광 및 비인포인화 기판을 해결하기 위해 큰 폴리 아크라이알라미드 젤에 의존하는 것입니다. 이 프로토콜은 이러한 큰 젤을 붓고 그렇게 할 때 일반적인 함정을 피하는 방법에 대한 구체적인 세부 정보를 제공합니다.
RNA로 일하는 것은 저하에 강하게 영향을 받기 쉽기 때문에 특별한 주의가 필요합니다. ribonuclease 오염을 제한하기 위해 취할 수있는 간단한 예방 단계가 있습니다. RNase 억제제 함유 세정제로 쉽게 치료할 수 있는 별도의 RNA 워크스테이션이 종종 도움이 됩니다. 샘플을 취급하고 RNase가없는 인증 소모품을 사용할 때 항상 장갑을 착용해야합니다. 물은 오염의 또 다른 일반적인 소스이기 때문에, 0.22 μm 필터를 사용하여 갓 정제 된 물을 사용하고 모든 솔루션을 살균하는 것이 가장 좋습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

폴리뉴클레오티드 키나아제(PNKs)는 DNA와 RNA 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 끝의 인산화를 촉매하는 효소이다. PNK의 활동은 직접 또는 간접 접근 방식을 사용하여 정량화될 수 있습니다. 여기에 제시된 형광표지 올리고뉴클레오티드 기판 및 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의존하는 PNK 활성을 측정하는 직접적인 시험관내 접근법이 여기에 제시된다. 이 방법은 무선 표지기기의 사용을 피하면서 인산 제품의 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜은 인산화 반응을 설정하고, 대형 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고, 반응 제품을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 분석의 가장 기술적으로 도전적인 부분은 큰 폴리 아크릴 아미드 젤을 붓고 실행하는 것입니다; 따라서 공통의 어려움을 극복하기 위한 중요한 세부 사항이 제공됩니다. 이 프로토콜은 Grc3, 결합 파트너, Las1 nuclease와 의무 사전 리보소말 RNA 처리 복합체로 조립 하는 PNK에 대 한 최적화 되었다. 그러나, 이 프로토콜은 다른 PNK 효소의 활성을 측정하도록 적응될 수 있다. 더욱이, 이러한 분석은 또한 뉴클레오시드 삼위산염, 금속 이온 및 올리고뉴클레오티드와 같은 반응의 상이한 성분의 효과를 결정하기 위해 수정될 수 있다.

Las1-Grc3 복합체의 고정된 양을 가진 ATP의 적정의 성공적인 대표적인 데스팅 젤이 도 1에도시된다. 효소의 첨가는 SC-ITS2 RNA 기판의 Las1 매개 RNA 분열의 결과로, 정의된 RNA 단편(5-OH C2 RNA)으로 이끌어 냈다. ATP의 첨가 시, C2 RNA 단편은 Grc3 PNK(5-P C2 RNA)에 의해 인포화되었다. 겔을 데스팅하는 데 인은 포인화 된 RNA가 비인포인화 대응보다 빠르게 이동합니다....

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

이 방법은 폴리뉴클레오티드 키나아제로 알려진 효소의 특별한 클래스에 의해 DNA 또는 RNA 분자의 5-프라임 엔드의 인산화에 대한 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 와 RNA 기판에 있는 아주 작은 변경을 검출하는 해상도가 있다는 것입니다. RNA 효소 키나아제 반응을 준비하여 시작합니다.각 반응에 대해, 500 나노 몰라 RNA 기판의 하나의 마이크로 리터를 결합. 8.3 마이크로리터 130 나노몰라 마지막 하나, GRC 3 및 0.2 5 밀리머 EDTA의 마이크로 리터. 열 블록을 섭씨 37도로 설정합니다.그런 다음 농도 계열에서 ATP 서브 스톡의 0.5 마이크로리터를 하나의 RNA 효소 혼합물과 혼합하고 열 블록에 반응을 배치합니다. 반응을 계속 혼합하고 열 블록에 10 초 간격으로 배치합니다. 히트 블록에 60 분 인큐베이션 후, 우레아 로딩 염료의 10 마이크로 리터로 스파이크하여 각 반응을 담금질.즉시 다운스트림 분석을 수행하거나 나중에 분석할 수 있는 음수 섭씨 20도에 반응을 저장합니다. 15%의 데니어링 아크릴아미드 젤 용액을 준비하려면 22.5밀리리터의 사전 혼합 40%29~1개의 아크릴아미드/비스 아크릴아미드 용액을 결합합니다. 10 x TBE의 6 밀리리터.28.8 그램의 우레아. 그리고 RNase는 총 59 밀리리터에 물을 무료. 그런 다음 용액을 부드럽게 저어줍니다.전자레인지에서 20초 동안 용액을 가열합니다. 저어서 즉시 전자레인지에 20초 간 반납합니다. 우레아가 완전히 녹을 때까지 용액을 부드럽게 저어줍니다.유리 비커를 5분 동안 차가운 물이 들어 있는 얕은 수조에 넣고 유리 비커를 둘러싼 차가운 물의 수준이 유리 비커 내부의 용액 수준 보다 높은지 확인합니다. 용액이 시원할 때, 0.2 마이크로미터 일회용 여과 장치로 필터를 제거하고 미립자 및 미세한 기포를 제거합니다. 비누와 물로 짧고 긴 유리 접시를 씻은 다음 각 접시에 95 %에탄올로 스프레이하고 유리를 닦아 수분을 제거하십시오.상자 위에 놓아 벤치 상단에서 긴 플레이트를 높이게 합니다. 그런 다음 플레이트의 긴 가장자리를 따라 0.4 밀리미터 스페이서를 배치합니다. 긴 접시 위에 짧은 접시를 놓고 짧은 플레이트, 긴 플레이트 및 스페이서의 가장자리가 정렬되었는지 확인합니다.그런 다음 세 개의 균일하게 간격이 있는 금속 클램프로 각 면을 고정합니다. 아크릴아미드 용액에 24마이크로리터의 TEMED를 넣고 섞습니다. 그런 다음 10%APS의 600 마이크로리터를 추가하고 즉시 유리 플레이트 사이에 용액을 붓습니다.유리 접시 샌드위치 사이에 아크릴아미드 용액을 붓는 것은 정말 어려울 수 있습니다. 기포를 피하기 위해 솔루션을 붓는 동안 유리 접시 샌드위치를 누릅니다. 유리 접시 샌드위치 의 상단에 깨끗한 32 웰 빗을 조심스럽게 추가합니다.그리고 아크릴아미드가 30분 동안 중합되도록 한다. 젤을 실행하려면 열 블록을 섭씨 75도로 설정합니다. 금속 클램프를 제거합니다.그리고 철저하게 세척하고 유리 접시 샌드위치를 건조. 플레이트 샌드위치와 젤 장치를 짧은 플레이트와 함께 앞뒤로 배치하고 10 X TBE의 100 밀리리터를 1.9 리터의 RNase 프리 워터와 결합하여 0.5 X TBE 실행 버퍼를 준비합니다. 장치의 상부 및 하부 챔버에 실행 버퍼의 600 밀리리터를 추가합니다.젤에서 빗을 부드럽게 제거하고 주사기로 우물을 완전히 헹신다. 젤을 50 와트로 30분 동안 미리 실행합니다. 그런 다음 우물을 다시 헹양시십시오.포스트는 담금질 반응을 회전하고 3 분 동안 섭씨 75도에서 배양. 펄스 스핀을 반복하고 각 샘플의 10 마이크로리터를 젤에 즉시 로드합니다. 그런 다음 50 와트에서 3 시간 동안 젤을 실행합니다.실행이 완료되면 전원 공급 장치를 끄고 장치의 상부 챔버를 배출하십시오. 유리 접시 샌드위치의 바깥쪽을 씻고 건조시다. 그런 다음 호일로 덮고 레이저 스캐너로 전달하여 이미징을 합니다.레이저 스캐너의 무대에 유리 플레이트 샌드위치를 마운트합니다. 원하는 바닥에 대한 여기 및 방출 파장을 설정하고 젤을 이미지화합니다. 여기에 표시된 것은 마지막 하나의 GRC 3 복합체의 고정된 양을 가진 ATP의 적정의 대표적인 성공적인 데스팅 젤이다.효소의 첨가는 Saccharomyces cerevisiae ITS 2 RNA 기판의 마지막 1개의 중재된 RNA 분열 귀착되고, 정의된 RNA 단편으로 이끌어 냈다. ATP의 첨가 시, C2 RNA 단편은 GrC3 PNK에 의해 인포화되었다. C2 RNA 단편의 인산화를 시각화하기 위해, 인포싱및 인포증 C2 RNA의 상대적 양은 ATP 농도에 대하여 플롯되었다.우리의 대표적인 실패한 데마링 젤이 여기에 표시됩니다. 21개의 뉴클레오티드 RNA 기판에는 인산화 된 제품과 겹쳐서 인산화를 정확하게 정량화하는 것이 불가능하게 만든 분해 생성물이 포함되어 있습니다. 대조적으로, 가장 짧은 RNA 분해 생성물은 겔의 이 지역이 인산화된 대응물의 정확한 정량화를 방해하는 추가 RNA 종을 포함하지 않았기 때문에 성공적으로 분석될 수 있었다.이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 샘플의 로딩을 보장하기 위해 젤의 우물을 헹두는 것입니다. 이 절차에 따라 RNA 회전율 실험을 수행할 수 있습니다. RNA 분해의 비율을 측정하기 위하여는, 인산화는 수시로 RNA 분해의 개시를 신호합니다.이 기술은 폴리뉴클레오티드 키나아제의 활동 특이성 및 운동성에 대한 상세한 질문에 대답할 수 있는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

연구

생화학

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

단일 뉴클레오티드 해상도로 리보솜 전좌의 메커니즘을 연구하는 이중 DNA 통치자

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...