Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Vi takker Dr. Andrew Sikkema og Andrea Kaminski for deres kritiske lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S) og Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 til M.C.P).

1. Forberedelse
<ol><li>Klargjør buffer og reagenser.<ol>
<li>Lag 1x reaksjonsbuffer ved å kombinere 20 μL på 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μL på 5 M natriumklorid, 2,5 μL på 2 M magnesiumklorid, 100 μL på 50 % (v/v) glyserol og RNasefritt vann for å nå et totalt volum på 1 ml.</li>
		<li>Gjør urea lasting fargestoff ved å kombinere 4,8 g urea, 200 μL på 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL på 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1 % (w/v) bromofenolblått og RNasefritt vann for å nå et totalt volum på 10 ml.</li>
		<li...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Beskrevet er en analyse for å måle kinaseaktiviteten til Grc3 PNK på fluorescerende merkede nukleotidunderstrater. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere andre PNK enzymer ved å tilpasse reaksjonsbufferen og oligonukleotidsubstratet. Protokollen krever for eksempel et sporbeløp på EDTA. Tilsetning av EDTA er gunstig av to grunner: For det første favoriserer denne tilnærmingen magnesiumbundet Grc3 ved å forhindre at enzymet bindes til spormengder av forurensende metaller i blandingen. For det andre hem...

Polynukleotid kinases (PNK) spille kritiske roller i mange DNA og RNA behandlingsveier, for eksempel DNA reparasjon og ribosommontering 1,2,3,4,5. Disse grunnleggende enzymene katalyserer overføringen av terminalen (gamma) monofosfat fra et nukleosidtriafosfat (NTP, oftest ATP) til 5' hydroksylende av et nukleotidsubstrat. En av de mest godt karakteriserte PNKs er bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat spesifisitet og er tungt utnyttet av molekylærbiologi laboratorier for å innlemme radioaktive isotop etiketter på 5 terminus av et DNA eller RNA substrat6,7,8,9,10,11,12. Et annet eksempel på et PNK-enzym er CLP1, som finnes i Eukarya, Eubacteria og Archaea, og er innblandet i flere RNA-behandlingsveier4,,13,,14,,15.
Historisk sett er de fleste analyser som måler polynukleotidkinaseaktivitet avhengig av radioaktiv isotopmerking og påfølgende autoradiografi5,16. I de senere årene har en rekke ekstra analyser blitt utviklet for å måle PNK-aktivitet, inkludert enkeltmolekyltilnærminger, mikrochipelektroforese, molekylære beacons, samt kolorimetriske og luminescence-baserte analyser17,18,19,20,21,22. Mens mange av disse nye tilnærmingene gir forbedrede deteksjonsgrenser og unngår bruk av radioaktivitet, har hver av dem ulemper, for eksempel kostnader, avhengighet av immobilisert harpiks og begrensninger i substratvalg.
Grc3 er en polynukleotid kinase som spiller en avgjørende rolle i behandlingen av pre-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 danner et obligatorisk kompleks med endoribonuclease Las1, som cleaves den interne transkriberte Spacer 2 (ITS2) av pre-ribosomal RNA3. Cleavage av ITS2 av Las1 genererer et produkt som huser en 5 'hydroxyl som senere fosforylert av Grc3 kinase3. For å undersøke nukleotid og substrat spesifisitet av Grc3, en billig analyse som tillot testing av forskjellige oligonukleotid underlag var nødvendig. Derfor ble det utviklet en PNK fosforyleringsanalyse ved hjelp av fluorescerende merkede substrater. Denne analysen ble brukt til å fastslå at Grc3 kan bruke en hvilken som helst NTP for fosforyloverføringsaktivitet, men favoriserer ATP24. Denne protokollen tilpasser den opprinnelige analysen for å måle PNK-aktiviteten til Grc3 på en RNA-etterligning av det pre-ribosomale RNA-substratet (SC-ITS2, tabell 1). Et utfordrende aspekt ved denne fluorescensbaserte tilnærmingen er avhengigheten av store polyakrylamidgeler for effektivt å løse fosforylert og ikke-fosforylerte underlag. Protokollen gir spesifikke detaljer om hvordan du kan helle disse store gelene og unngå vanlige fallgruver når du gjør det.
Arbeid med RNA krever spesiell forsiktighet fordi det er sterkt utsatt for nedbrytning. Det er enkle forebyggende skritt man kan ta for å begrense ribonuclease forurensning. En separat RNA-arbeidsstasjon som enkelt kan behandles med et RNase-hemmerholdig rengjøringsmiddel er ofte nyttig. Bruk alltid hansker ved håndtering av prøver og bruk av RNase-frie sertifiserte forbruksvarer er nødvendig. Fordi vann er en annen vanlig forurensningskilde, er det best å bruke nyrenset vann og sterilisere alle løsninger ved hjelp av et 0,22 μm filter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Polynukleotidkinaser (PNKs) er enzymer som katalyserer fosforyleringen av 5' hydroksylende dna og RNA oligonukleotider. Aktiviteten til PNKs kan kvantifiseres ved hjelp av direkte eller indirekte tilnærminger. Presentert her er en direkte, in vitro tilnærming for å måle PNK aktivitet som er avhengig av en fluorescerende merket oligonucleotide substrat og polyakrylamid gel elektroforese. Denne tilnærmingen gir oppløsning av fosforylert produkter samtidig som du unngår bruk av radiomerkede underlag. Protokollen beskriver hvordan man setter opp fosforyleringsreaksjonen, forbereder og kjører store polyakrylamidgeler og kvantifiserer reaksjonsproduktene. Den mest teknisk utfordrende delen av denne analysen er å helle og kjøre de store polyakrylamidgelene; Dermed er viktige detaljer for å overvinne vanlige vanskeligheter gitt. Denne protokollen ble optimalisert for Grc3, en PNK som monteres i et obligatorisk pre-ribosomal RNA-behandlingskompleks med sin bindende partner, Las1-kjernen. Denne protokollen kan imidlertid tilpasses for å måle aktiviteten til andre PNK-enzymer. Videre kan denne analysen også endres for å bestemme effekten av forskjellige komponenter i reaksjonen, for eksempel nukleosidtrifosfat, metallioner og oligonukleotider.

En vellykket representativ denaturing gel av en titrering av ATP med en fast mengde Las1-Grc3 kompleks er vist i figur 1. Tilsetning av enzym resulterte i Las1-mediert RNA-spaltning av SC-ITS2 RNA-substratet, noe som førte til et definert RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Ved tilsetning av ATP ble C2 RNA-fragmentet fosforylert av Grc3 PNK (5-P C2 RNA). I denaturing geler fosforyler RNA migrerer raskere enn sin ukosforylert motstykke. Som vist i <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Denne protokollen beskriver en ikke-radioaktiv analyse for å måle kinaseaktiviteten til polynukleotidkinaser (PNKs) på små DNA- og RNA-substrater.

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Denne metoden kan svare på viktige spørsmål om fosforyleringen av den fem-prime enden av DNA- eller RNA-molekylene ved en spesiell klasse enzymer kjent som polynukleotidkinase. Den største fordelen med denne teknikken er at den har oppløsningen til å oppdage svært små endringer i DNA- og RNA-substrater. Begynn med å forberede RNA-enzymet kinase reaksjoner.For hver reaksjon, kombinere en mikroliter på 500 nanomolar RNA substrat. 8,3 mikroliter på 130 nanomolar siste, GRC tre og 0,2 mikroliter på fem millimolar EDTA. Sett varmeblokken til 37 grader Celsius.Bland deretter 0,5 mikroliter av en ATP-underlager fra konsentrasjonsserien med en RNA-enzymblanding og plasser reaksjonen på varmeblokken. Fortsett å blande reaksjonene og legg dem på varmeblokken med ti sekunders intervaller. Etter en 60 minutters inkubasjon på varmeblokken, slukke hver reaksjon ved å spiking den med 10 mikroliter urea lasting fargestoff.Utfør umiddelbart nedstrømsanalyse eller lagre reaksjonene ved negative 20 grader Celsius som skal analyseres på et senere tidspunkt. For å forberede en 15% denaturing akrylamid gel løsning, kombinere 22,5 milliliter pre-blandet 40%29 til en akrylamid / bis akrylamid løsning. Seks milliliter på ti x TBE.28,8 gram urea. Og RNase fritt vann til et totalt volum på 59 milliliter. Rør deretter forsiktig løsningen.Varm opp løsningen i mikrobølgeovnen i 20 sekunder. Rør den og returner den umiddelbart til mikrobølgeovnen i ytterligere 20 sekunder. Rør forsiktig løsningen til urea er fullstendig oppløst.Legg glassbegeret i et grunt vannbad, som inneholder kaldt vann i fem minutter, og pass på at nivået av kaldt vann rundt glassbegeret er over oppløsningsnivået inne i glassbegeret. Når løsningen er avkjølt, må du filtrere og avgasse den med en engangsfiltreringsenhet på 0,2 mikrometer for å fjerne partikler og mikroskopiske luftbobler. Vask en kort og lang glassplate med såpe og vann og spray deretter hver plate med 95% etanol og tørk av glasset for å fjerne fuktighet.Løft den lange platen av benkeplaten ved å plassere den på toppen av en boks. Plasser deretter 0,4 millimeter avstandsslang langs langsidene på platen. Legg den korte platen på toppen av den lange platen, og pass på at kantene på den korte platen, langplaten og avstandsslene er justert.Klem deretter på hver side med tre jevnt fordelte metallklemmer. Tilsett 24 mikroliter TEMED til akrylamidoppløsningen og bland den. Tilsett deretter 600 mikroliter på 10% APS og hell umiddelbart løsningen mellom glassplatene.Det kan være veldig utfordrende å helle akrylamidløsningen mellom glassplatens sandwich. For å unngå luftbobler, trykk på glassplatesmørbrødet mens du heller løsningen. Tilsett forsiktig en ren 32-brønns kam til toppen av glassplatens sandwich.Og la akrylamidet polymerisere i 30 minutter. For å kjøre gelen, sett varmeblokken til 75 grader Celsius. Fjern metallklemmene.Og vask og tørk glassplatens sandwich grundig. Plasser platesmørbrødet og gelapparatet med den korte platen vendt fremover og klargjør 0,5 X TBE løpebuffer ved å kombinere 100 milliliter 10 X TBE med 1,9 liter RNase fritt vann. Tilsett 600 milliliter av løpebufferen til de øvre og nedre kamrene i apparatet.Fjern forsiktig kammen fra gelen og skyll brønnene grundig med en sprøyte. Forhåndsdrevne gelen på 50 Watt i 30 minutter. Skyll deretter brønnene igjen.Post spinne slukke reaksjoner og inkubere dem på 75 grader Celsius i tre minutter. Gjenta pulsspinnen og legg umiddelbart 10 mikroliter av hver prøve på gelen. Kjør deretter gelen i tre timer ved 50 Watt.Når løpet er ferdig, slå av strømforsyningen og tøm det øvre kammeret av apparatet. Vask og tørk den ytre siden av glassplaten sandwich. Dekk den deretter med folie og overfør den til en laserskanner for avbildning.Monter glassplatens sandwich på scenen på laserskanneren. Sett eksitasjon og utslipp bølgelengder for ønsket gulv for og bilde gelen. Vist her er en representativ vellykket denaturing gel av en titrering av ATP med en fast mengde siste EN GRC tre kompleks.Tilsetning av enzym resulterte i siste mediert RNA-spaltning av Saccharomyces cerevisiae ITS to RNA-substrat, noe som førte til et definert RNA-fragment. Ved tilsetning av ATP ble C2 RNA-fragmentet fosforylert av GrC3 PNK. For å visualisere fosforyleringen av C2 RNA-fragmentet ble den relative mengden ukosforylert og fosforylert C2 RNA plottet mot ATP-konsentrasjonen.Vår representative mislykkede denaturing gel er vist her. 21 nukleotid RNA-substratet inneholdt nedbrytningsprodukter, som overlappet med fosforylert produkt og gjorde det umulig å nøyaktig kvantifisere fosforylering. I motsetning kan det korteste RNA-nedbrytningsproduktet analyseres med hell fordi dette området av gelen ikke inneholdt noen ekstra RNA-arter som hindret nøyaktig kvantifisering av sin fosforylert motstykke.Det viktigste å huske når du prøver denne protokollen er å skylle brønnene på gelen for å sikre jevn lasting av prøven. Etter denne prosedyren kan et RNA-omsetningseksperiment utføres. For å måle frekvensen av RNA-nedbrytning signaliserer fosforylering ofte initiering av RNA-nedbrytning.Denne teknikken baner vei for å svare på detaljerte spørsmål om aktivitetene spesifisitet og kinetikk av polynukleotid kinaser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dual DNA herskere å studere mekanismen for ribosom translokasjon med single-nukleotid oppløsning

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Bruke en ekstracellulære Flux Analyzer til å måle endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under Mouse sperm Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling av nukleotidbinding til intakte, funksjonelle membranproteiner i sanntid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...