Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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Agradecemos ao Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramuros do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR; 146626 a M.C.P).

1. Preparação
<ol><li>Prepare tampão e reagentes.<ol>
<li>Faça 1x Tampão de Reação combinando 20 μL de 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μL de cloreto de sódio de 5 M, 2,5 μL de cloreto de magnésio de 2 M, 100 μL de 50% (v/v) glicerol e água livre de RNase para atingir um volume total de 1 mL.</li>
		<li>Faça corante de carregamento de ureia combinando 4,8 g de ureia, 200 μL de 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL de 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL de 1% (w/v) azul bromofenol e água livre de RNase para atingir um volume to...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. 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M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Descrito é um ensaio para medir a atividade de quinase do Grc3 PNK em substratos de nucleotídeos fluorescentes. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar outras enzimas PNK adaptando o buffer de reação e o substrato de oligonucleotídeo. Por exemplo, o protocolo exige uma quantidade de traço de EDTA. A adição de EDTA é benéfica por duas razões: Primeiro, essa abordagem favorece o Grc3 ligado ao magnésio, impedindo que a enzima se ligue a vestígios de metais contaminantes na mistura. Em segundo lugar,...

As quinases de polinucleotídeos (PNK) desempenham papéis críticos em muitas vias de processamento de DNA e RNA, como reparação de DNA e conjunto ribossomo1,,2,,3,,4,,5. Essas enzimas fundamentais catalisam a transferência do monofosfato terminal (gama) de um triptofato nucleosídeo (NTP, na maioria das vezes ATP) para a extremidade hidroxila de 5' de um substrato nucleotídeo. Um dos PNKs mais bem caracterizados é o bacteriófago T4 PNK, que tem ampla especificidade de substrato e é fortemente utilizado por laboratórios de biologia molecular para incorporar rótulos de isótopos radioativos no 5 terminus de um substrato de DNA ou RNA6,7,,8,,9,10,,11,12. Outro exemplo de enzima PNK é o CLP1, que é encontrado em Eukarya, Eubacteria e Archaea, e está implicado em várias vias de processamento de RNA4,,13,,14,15.
Historicamente, a maioria dos ensaios que medem a atividade de quinase polinucleotídeo dependem da rotulagem de isótopos radioativos e da autoradiografia subsequente5,16. Nos últimos anos, uma série de ensaios adicionais foram desenvolvidos para medir a atividade de PNK, incluindo abordagens de molécula única, eletroforese de microchip, balizas moleculares, bem como ensaios colorimétricos e baseados em luminescência17,,18,,19,,20,21,22. Embora muitas dessas novas abordagens forneçam limites de detecção aprimorados e evitem o uso de radioatividade, cada uma tem desvantagens, como custo, dependência de resina imobilizada e limitações na escolha do substrato.
Grc3 é um polinucleotídeo quinase que desempenha um papel fundamental no processamento do RNA pré-ribossômico2,3,23. Grc3 forma um complexo obrigatório com o endoribonuclease Las1, que corta o Spacer Transcrito Interno 2 (ITS2) do RNA pré-ribossômico3. O decote do ITS2 por Las1 gera um produto que abriga um hidroxil de 5' que é posteriormente fosforilado pela quinase Grc33. Para investigar a especificidade do nucleotídeo e substrato do Grc3, foi necessário um ensaio barato que permitia o teste de diferentes substratos oligonucleotídeos. Por isso, foi desenvolvido um ensaio de fosforilação PNK usando substratos fluorescentes rotulados. Este ensaio foi usado com sucesso para determinar que o Grc3 pode utilizar qualquer NTP para atividade de transferência de fosforila, mas favorece o ATP24. Este protocolo adapta o ensaio original para medir a atividade PNK de Grc3 em uma mímica de RNA de seu substrato de RNA pré-ribossômico (SC-ITS2, Tabela 1). Um aspecto desafiador dessa abordagem baseada em fluorescência é a dependência de grandes géis de poliacrilamida para resolver efetivamente substratos fosforilados e não fosforilados. O protocolo fornece detalhes específicos sobre como derramar esses géis grandes e evitar armadilhas comuns ao fazê-lo.
Trabalhar com RNA requer cuidados particulares porque é fortemente suscetível à degradação. Existem medidas preventivas simples que se pode tomar para limitar a contaminação por ribonuclease. Uma estação de trabalho RNA separada que pode ser facilmente tratada com um agente de limpeza contendo inibidores de RNase é muitas vezes útil. É sempre necessário usar luvas ao manusear amostras e usar materiais de consumo certificados sem RNase. Como a água é outra fonte comum de contaminação, é melhor usar água recém-purificada e esterilizar todas as soluções usando um filtro de 0,22 μm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

As quinases de polinucleotídeos (PNKs) são enzimas que catalisam a fosforilação da extremidade hidroxila de 5' do DNA e oligonucleotídeos de RNA. A atividade dos PNKs pode ser quantificada por meio de abordagens diretas ou indiretas. Apresentada aqui é uma abordagem direta e in vitro para medir a atividade PNK que se baseia em um substrato de oligonucleotídeo fluorescente e eletroforese de gel de poliacrilamida. Esta abordagem fornece a resolução dos produtos fosforilados, evitando o uso de substratos radiolabelados. O protocolo detalha como configurar a reação de fosforilação, preparar e executar grandes géis de poliacrilamida e quantificar os produtos de reação. A parte mais tecnicamente desafiadora deste ensaio é derramar e executar os grandes géis de poliacrilamida; assim, são fornecidos detalhes importantes para superar as dificuldades comuns. Este protocolo foi otimizado para o Grc3, um PNK que se reúne em um complexo de processamento de RNA pré-ribossômico obrigatório com seu parceiro de ligação, o nuclease Las1. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para medir a atividade de outras enzimas PNK. Além disso, este ensaio também pode ser modificado para determinar os efeitos de diferentes componentes da reação, como o triphosfato nucleosídeo, íons metálicos e oligonucleotídeos.

Um gel de desnaturamento representativo bem-sucedido de uma titulação de ATP com uma quantidade fixa do complexo Las1-Grc3 é mostrado na Figura 1. A adição de enzima resultou no decote de RNA mediado em Las1 do substrato RNA SC-ITS2, levando a um fragmento de RNA definido (5-OH C2 RNA). Após a adição de ATP, o fragmento de RNA C2 foi fosfoilado por Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Em géis desnaturação, o RNA fosfoilado migra mais rápido do que sua contrapar...

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Este método pode responder a perguntas-chave sobre a fosforilação da extremidade cinco-prime das moléculas de DNA ou RNA por uma classe especial de enzimas conhecidas como cinase de polinucleotídeos. A principal vantagem dessa técnica é que ela tem a resolução de detectar pequenas alterações no DNA e substratos de RNA. Comece preparando as reações de quinase da enzima RNA.Para cada reação, combine um microliter de 500 substrato de RNA nanomolar. 8,3 microliters de 130 nanomolars últimos, 3 GRC e 0,2 microliters de cinco mililitros EDTA. Coloque o bloco de calor em 37 graus Celsius.Em seguida, misture 0,5 microliters de um sub estoque ATP da série de concentração com uma mistura de enzima RNA e coloque a reação no bloco de calor. Continue misturando as reações e colocando-as no bloco de calor em intervalos de dez segundos. Após uma incubação de 60 minutos no bloco de calor, sacie cada reação, espiando-a com 10 microliters de corante de carregamento de ureia.Realize imediatamente a análise a jusante ou armazene as reações a 20 graus Celsius negativos a serem analisadas posteriormente. Para preparar uma solução de gel de acrilamida de 15% de desnaturação, combine 22,5 mililitros de solução pré-misturada de 40%29 a uma solução de acrilamida/bis. Seis mililitros de dez x TBE.28,8 gramas de ureia. E rnase água livre para um volume total de 59 mililitros. Em seguida, mexa suavemente a solução.Aqueça a solução no micro-ondas por 20 segundos. Mexa-o e devolva-o imediatamente ao micro-ondas por mais 20 segundos. Mexa suavemente a solução até que a ureia esteja completamente dissolvida.Coloque o béquer de vidro em um banho de água rasa, contendo água fria por cinco minutos, certificando-se de que o nível de água fria ao redor do copo de vidro esteja acima do nível de solução dentro do copo de vidro. Quando a solução estiver fria, filtre-a e desafocar com uma unidade de filtragem descartável de 0,2 micrômetro para remover partículas e bolhas de ar microscópicas. Lave uma placa de vidro curta e longa com água e sabão, depois pulverize cada prato com 95% de etanol e limpe o copo para remover qualquer umidade.Eleve a placa longa do topo do banco colocando-a em cima de uma caixa. Em seguida, posicione espaçadores de 0,4 milímetros ao longo das bordas longas da placa. Coloque a placa curta em cima da placa longa, certificando-se de que as bordas da placa curta, placa longa e espaçadores estejam alinhados.Em seguida, aperte cada lado com três grampos metálicos espaçados uniformemente. Adicione 24 microliters de TEMED à solução de acrilamida e misture-a. Em seguida, adicione 600 microliters de 10% APS e despeje imediatamente a solução entre as placas de vidro.Derramar a solução de acrilamida entre o sanduíche de placa de vidro pode ser realmente desafiador. Para evitar bolhas de ar, toque no sanduíche de placa de vidro enquanto estiver servindo sua solução. Adicione cuidadosamente um pente limpo de 32 poços na parte superior do sanduíche de placa de vidro.E deixe a acrilamida polimerizar por 30 minutos. Para executar o gel, coloque o bloco de calor em 75 graus Celsius. Remova os grampos metálicos.E lave bem e seque o sanduíche de prato de vidro. Posicione o sanduíche de placa e o aparelho de gel com a placa curta voltada para a frente e prepare o tampão de corrida 0,5 X TBE combinando 100 mililitros de 10 X TBE com 1,9 litros de água livre RNase. Adicione 600 mililitros do buffer de execução às câmaras superior e inferior do aparelho.Retire suavemente o pente do gel e enxágue bem os poços com uma seringa. Pré-execute o gel em 50 Watts por 30 minutos. Em seguida, enxágue os poços novamente.Depois gire as reações de saciar e incuba-las a 75 graus Celsius por três minutos. Repita o giro de pulso e carregue imediatamente 10 microlitros de cada amostra no gel. Em seguida, executar o gel por três horas em 50 Watts.Quando a corrida terminar, desligue a fonte de alimentação e drene a câmara superior do aparelho. Lave e seque o lado externo do sanduíche de placa de vidro. Em seguida, cubra-o com papel alumínio e transfira-o para um scanner a laser para imagens.Coloque o sanduíche de placa de vidro no palco do scanner laser. Defina os comprimentos de onda de excitação e emissão para o piso desejado e imagem do gel. Mostrado aqui é um gel de desnaturamento bem-sucedido representativo de uma titulação de ATP com uma quantidade fixa de um último GRC três complexo.A adição de enzima resultou no último decote de RNA mediado do Saccharomyces cerevisiae SEU substrato de RNA, levando a um fragmento de RNA definido. Após a adição de ATP, o fragmento de RNA C2 foi fosfoilado pela GrC3 PNK. Para visualizar a fosforilação do fragmento de RNA C2, a quantidade relativa de C2 RNA não fosforilado e fosforilado foi plotada contra a concentração atp.Nosso representante de gel de desnaturing sem sucesso é mostrado aqui. O substrato rna nucleotídeo de 21 nucleotídeos continha produtos de degradação, que se sobrepunham ao produto fosforilado e impossibilitaram quantificar com precisão a fosforilação. Em contraste, o produto de degradação de RNA mais curto poderia ser analisado com sucesso porque esta área do gel não continha nenhuma espécie adicional de RNA que impedisse a quantificação precisa de sua contraparte fosfoilada.O mais importante a ser lembrado ao tentar este protocolo é enxaguar os poços do gel para garantir o carregamento uniforme da sua amostra. Após este procedimento, um experimento de rotatividade de RNA poderia ser realizado. Para medir as taxas de degradação do RNA, a fosforilação muitas vezes sinaliza o início da degradação do RNA.Esta técnica abre caminho para responder perguntas detalhadas sobre a especificidade das atividades e cinéticas das cinesases polinucleotídeos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Bioquímica

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...