Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Эндрю Сиккему и Андреа Каминский за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований Национального института здравоохранения США; Национальный институт наук об охране окружающей среды США (NIEHS; ЗИЯ ES103247 в Р.Е.С.) и Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR; 146626 до M.C.P).

1. Подготовка
<ol><li>Подготовка буфера и реагентов.<ol>
<li>Сделайте 1x Реакцию Буфер, объединив 20 йл 1 M Tris (рН 8,0), 40 МКЛ из 5 M хлорида натрия, 2,5 йл 2 M хлорида магния, 100 йл 50% (v/v) глицерол, и RNase-свободной воды для достижения общего объема 1 мл.</li>
		<li>Сделайте краситель для загрузки мочевины, объедини?...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Описанный анализ для измерения активности киназы Grc3 PNK на флуоресцентно помеченных нуклеотидных субстратах. Этот протокол может быть применен для характеристики других ферментов PNK путем адаптации реакции буфера и олигонуклеотида субстрата. Например, протокол требует отслеживания к?...

Полинуклеотидные киназы (PNK) играют важную роль во многих путях обработки ДНК и РНК, таких как ремонт ДНК и рибосомнаясборка 1,,2,,3,,4,,5. Эти фундаментальные ферменты катализирует перенос терминального (гамма) монофосфата из нуклеозидного трифосфата (NTP, чаще всего АТФ) в 5' гидроксиловый конец нуклеотидного субстрата. Один из наиболее хорошо характеризуется PNKs является бактериофаг T4 PNK, который имеет широкую специфику субстрата и в значительной степени используется молекулярной биологии лабораторий для включения радиоактивных изотопов этикетки на 5 конечной части ДНК или РНКсубстрата 6,7,8,9,10,11,12. Другим примером фермента PNK является CLP1, который находится в Eukarya, Eubacteria, и Archaea, и замешан в нескольких путейобработки РНК 4,13,14,15.
Исторически сложилось так, что большинство анализов, которые измеряют активность полинуклеотида киназы зависят от радиоактивной маркировки изотопов и последующейауторадиографии 5,16. В последние годы был разработан ряд дополнительных анализов для измерения активности PNK, включая подходы к одной молекуле, электрофорез микрочипа, молекулярные маяки, а также колоритетрические и люминесцентныеанализы 17,,18,,19,,20,,21,,22. Хотя многие из этих новых подходов обеспечивают более расширенные пределы обнаружения и избегают использования радиоактивности, каждый из них имеет недостатки, такие, как стоимость, опора на иммобилизованную смолу и ограничения в выборе субстрата.
Grc3 является полинуклеотидной киназы, которая играет ключевую роль в обработке до рибосомнойРНК 2,3,23. Grc3 образует обязательный комплекс с эндорибонуклеазой Las1, которая расщепляет внутренний транскрибированный Spacer 2 (ITS2) до рибосомнойРНК 3. Расщепление ITS2 по Las1 генерирует продукт укрывательство 5' гидроксил, который впоследствии фосфорилируется Grc3 киназы3. Для исследования нуклеотидной и субстратной специфичности Grc3 требовался недорогой анализ, который позволил провести тестирование различных олигонуклеотидных субстратов. Поэтому был разработан фосфорилирующий анализ PNK с использованием флуоресцентно помеченных субстратов. Этот анализ был успешно использован для определения того, что Grc3 может использовать любой NTP для передачи фосфорила деятельности, но выступает заАТФ 24. Этот протокол адаптирует исходный анализ для измерения активности PNK Grc3 на РНК, имитируя его до рибосомный субстрат РНК (SC-ITS2, таблица 1). Одним из сложных аспектов этого подхода, основанного на флуоресценции, является использование крупных полиакриламидных гелей для эффективного решения фосфорилированных и нефосфорилированных субстратов. Протокол содержит конкретные сведения о том, как залить эти большие гели и избежать распространенных ловушек при этом.
Работа с РНК требует особого ухода, поскольку она сильно подвержена деградации. Есть простые профилактические шаги можно предпринять, чтобы ограничить загрязнение рибонуклеазы. Отдельная рабочая станция РНК, которую можно легко лечить с помощью ингибитора RNase, содержащего моющие средства часто полезно. Всегда носить перчатки при обработке образцов и использование RNase без сертифицированных расходных материалов необходимо. Поскольку вода является еще одним распространенным источником загрязнения, лучше всего использовать свежеочищенную воду и стерилизовать все растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Полинуклеотидные киназы (PNKs) являются ферментами, которые катализинцирует фосфорилирование 5' гидроксилового конца ДНК и РНК-олигонуклеотидов. Активность НРК можно количественно оценить с помощью прямых или косвенных подходов. Представлено здесь прямой, in vitro подход к измерению активности PNK, который опирается на флуоресцентно помечены олигонуклеотид субстрат и полиакриламид гель электрофорез. Такой подход обеспечивает разрешение фосфорилированных продуктов, избегая при этом использования радиозабрюхированных субстратов. В протоколе подробно говорится о том, как настроить реакцию фосфорилирования, подготовить и запустить большие полиакриламидные гели, а также количественно определить реакционной продукции. Наиболее технически сложной частью этого анализа является заливка и запуск больших полиакриламидных гелей; таким образом, предоставляются важные детали для преодоления общих трудностей. Этот протокол был оптимизирован для Grc3, PNK, который собирается в обязательный предварительно рибосомный комплекс обработки РНК со своим связующим партнером, ядром Las1. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для измерения активности других ферментов PNK. Кроме того, этот анализ также может быть изменен для определения воздействия различных компонентов реакции, таких как нуклеозид трифосфат, ионы металла, и олигонуклеотиды.

Успешный репрезентативный денатурация геля титрования АТФ с фиксированным количеством комплекса Las1-Grc3 показана на рисунке 1. Добавление фермента привело к расщеплению РНК при посредничестве Las1 в субстрате РНК SC-ITS2, что привело к определенному фрагмен...

Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Этот протокол описывает нерадиоактивный анализ для измерения киназы активности полинуклеотидных кинасов (PNKs) на малых ДНК и РНК субстратов.

Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Этот метод может ответить на ключевые вопросы о фосфорилации пяти-премьер конце ДНК или РНК молекулы специального класса ферментов, известных как полинуклеотид киназы. Основным преимуществом этого метода является его разрешение для обнаружения очень небольших изменений в ДНК и РНК-субстратах. Начните с подготовки реакций фермента РНК киназы.Для каждой реакции объедините один микролитер из 500 наномолярных РНК-субстратов. 8.3 микролитров 130 наномолярных последних, GRC 3 и 0,2 микролитров пяти миллимолярной EDTA. Установите тепловой блок до 37 градусов по Цельсию.Затем смешайте 0,5 микролитров суб-запаса АТФ из серии концентраций с одной смесью фермента РНК и поместите реакцию на тепловой блок. Продолжайте смешивать реакции и помещайте их на тепловой блок с интервалом в десять секунд. После 60-минутной инкубации на тепловом блоке, утолить каждую реакцию, пики его с 10 микролитров мочевины загрузки красителя.Немедленно выполняте вниз по течению анализ или храните реакции на отрицательных 20 градусах Celsius, чтобы быть проанализированы на более поздний срок. Чтобы подготовить 15%denaturing акриламид гель раствор, объединить 22,5 миллилитров предварительно смешанных 40%29 к одному акриламида / бис акриламида раствора. Шесть миллилитров по десять х TBE.28,8 г мочевины. И RNase бесплатная вода в общей сложности 59 миллилитров. Затем аккуратно перемешать раствор.Нагрейте раствор в микроволновой печи в течение 20 секунд. Перемешать и немедленно вернуть его в микроволновую печь еще на 20 секунд. Аккуратно перемешайте раствор до полного растворения мочевины.Поместите стеклянный стакан в ванну на мелководье, содержащую холодную воду в течение пяти минут, убедившись, что уровень холодной воды, окружающей стеклянный стакан выше уровня раствора внутри стакана. Когда раствор остынет, процепив и от газе его с 0,2 два микрометра одноразовый блок фильтрации для удаления твердых частиц и микроскопических пузырьков воздуха. Вымойте короткую и длинную стеклянную тарелку с мылом и водой, затем распылите каждую тарелку 95%этанолом и протрите стекло, чтобы удалить влагу.Поднимите длинную пластину со скамейки сверху, поместив его на верхней части коробки. Затем распорежьте 0,4-миллиметровые проемы по длинным краям пластины. Положите короткую пластину поверх длинной пластины, убедившись, что края короткой пластины, длинной пластины и спейсеры выровнены.Затем зажим каждой стороны с тремя равномерно разметь металлические зажимы. Добавьте 24 микролитров TEMED в раствор акриламида и смешайте его. Затем добавьте 600 микролитров 10%APS и сразу же залейте раствор между стеклянными пластинами.Заливка акриламид решение между стеклянной пластины бутерброд может быть очень сложной задачей. Чтобы избежать пузырьков воздуха, нажмите сэндвич стеклянной пластины, пока вы заливки вашего решения. Аккуратно добавьте чистый гребень 32-хорошо в верхней части стеклянной пластины бутерброд.И дайте акриламиду полимеризуться в течение 30 минут. Чтобы запустить гель, установите тепловой блок до 75 градусов по Цельсию. Удалите металлические зажимы.И тщательно вымыть и высушить стеклянную тарелку бутерброд. Позиция пластины бутерброд и гель аппарат с короткой пластиной лицом вперед и подготовить 0,5 X TBE работает буфер, объединив 100 миллилитров 10 X TBE с 1,9 литров RNase свободной воды. Добавьте 600 миллилитров бегущего буфера в верхнюю и нижнюю камеры аппарата.Аккуратно снимите гребень с геля и тщательно промойте колодцы шприцем. Предварительно запустите гель при 50 Вт в течение 30 минут. Затем снова промыть колодцы.Сообщение спина утолить реакции и инкубировать их при 75 градусов по Цельсию в течение трех минут. Повторите вращение импульса и немедленно загрузите 10 микролитров каждого образца на гель. Затем запустите гель в течение трех часов при 50 Вт.Когда пробег закончится, выключите электроснабжение и слейте верхнюю камеру аппарата. Вымойте и высушите внешнюю сторону сэндвича стеклянной пластины. Затем накройте фольгой и перенесите на лазерный сканер для визуализации.Намонтировать сэндвич со стеклянной пластиной на сцену лазерного сканера. Установите возбуждение и выброс длин волн для желаемого пола и изображение геля. Здесь показан репрезентативный успешный денатурированный гель титрования АТФ с фиксированным количеством последнего комплекса GRC 3.Добавление фермента привело к последнему опосредованное расщепление РНК Saccharomyces cerevisiae ITS два РНК субстрата, что приводит к определенным фрагментом РНК. После добавления СПС фрагмент РНК С2 был фосфорилирован ГРК3 PNK. Для визуализации фосфорилирования фрагмента РНК С2 относительное количество нефосфорилированной и фосфорилированной РНК С2 было построено против концентрации АТФ.Наш представитель неудачных денатурации гель показан здесь. 21 нуклеотидный субстрат РНК содержал продукты деградации, которые пересекались с фосфорилированным продуктом и не позволяют точно количественно оценить фосфорилирование. В отличие от этого, кратчайший продукт деградации РНК может быть успешно проанализирован, потому что эта область геля не содержит каких-либо дополнительных видов РНК, которые препятствуют точной количественной оценки его фосфорилированного аналога.Самое главное помнить при попытке этого протокола, чтобы промыть колодцы геля, чтобы обеспечить даже загрузку вашего образца. После этой процедуры можно было бы провести эксперимент по обороту РНК. Для измерения темпов деградации РНК фосфорилирование часто сигнализирует о начале деградации РНК.Этот метод прокладывает путь для ответа на подробные вопросы о деятельности специфики и кинетики полинуклеотидных киназ.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Двойные линейки ДНК для изучения механизма транслокации рибосом с однонуклеотидной резолюцией

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Использование внеклеточного анализатора flux для измерения изменений в гликолизе и окислительной фосфорилации во время емки спермы мыши

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Измерение связывания нуклеотидов с интактными функциональными мембранными белками в режиме реального времени

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...