Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
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Agradecemos al Dr. Andrew Sikkema y Andrea Kaminski por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR; 146626 a M.C.P).

1. Preparación
<ol><li>Prepare el búfer y los reactivos.<ol>
<li>Haga 1x Buffer de Reacción combinando 20 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 40 ml de cloruro de sodio de 5 M, 2,5 l de cloruro de magnesio de 2 M, 100 l de 50% (v/v) de glicerol y agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 1 ml.</li>
		<li>Haga el tinte de carga de urea combinando 4,8 g de urea, 200 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 20 l de 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 0,5 ml de 1% (p/v) de agua libre de romo para alcanzar un volumen total de 10 mL.</li>
		<li>Hag...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. 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M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Se describe un ensayo para medir la actividad quinasa de Grc3 PNK en sustratos de nucleótidos con etiqueta fluorescente. Este protocolo se puede aplicar para caracterizar otras enzimas PNK adaptando el búfer de reacción y el sustrato de oligonucleótido. Por ejemplo, el protocolo requiere una cantidad de seguimiento de EDTA. La adición de EDTA es beneficiosa por dos razones: En primer lugar, este enfoque favorece grc3 unido al magnesio al impedir que la enzima se une a cantidades traza de metales contaminantes en la ...

Las quinasas polinucleótidas (PNK) desempeñan un papel fundamental en muchas vías de procesamiento de ADN y ARN, como la reparación del ADN y el ensamblaje ribosoma1,,2,,3,,4,,5. Estas enzimas fundamentales catalizan la transferencia del monofosfato terminal (gamma) de un trifosfato de nucleósido (NTP, más a menudo ATP) al extremo hidroxilo de 5' de un sustrato de nucleótido. Uno de los PNK más caracterizados es el bacteriófago T4 PNK, que tiene una amplia especificidad de sustrato y es muy utilizado por los laboratorios de biología molecular para la incorporación de etiquetas de isótopos radiactivos en el 5 terminus de un sustrato de ADN o ARN6,7,8,9,10,11,12. Otro ejemplo de una enzima PNK es CLP1, que se encuentra en Eukarya, Eubacteria y Archaea, y está implicado en varias vías de procesamiento de ARN4,13,14,15.
Históricamente, la mayoría de los ensayos que miden la actividad de polinucleótido quinasa dependen del etiquetado de isótopos radiactivos y de la posterior autoradiografía5,,16. En los últimos años se han desarrollado una serie de ensayos adicionales para medir la actividad de PNK, incluyendo enfoques de molécula única, electroforesis de microchip, balizas moleculares, así como ensayos colorimétricos y basados en luminiscencia17,18,19,20,21,22. Si bien muchos de estos nuevos enfoques proporcionan límites de detección mejorados y evitan el uso de radiactividad, cada uno tiene inconvenientes, como el costo, la dependencia de la resina inmovilizada y las limitaciones en la elección del sustrato.
Grc3 es un polinucleótido quinasa que desempeña un papel fundamental en el procesamiento de ARN pre-ribosomal2,3,23. Grc3 forma un complejo obligado con la endoribonucleasa Las1, que corta el Espaciador Transcrito Interno 2 (ITS2) del ARN pre-ribosomal3. Cleavage del ITS2 de Las1 genera un producto que alberga un hidroxilo de 5' que posteriormente es fosforilado por la Grc3 quinasa3. Para investigar la especificidad de nucleótidos y sustratos de Grc3, se requirió un ensayo barato que permitió realizar pruebas de diferentes sustratos de oligonucleótidos. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de fosforilación PNK utilizando sustratos con etiqueta fluorescente. Este ensayo se utilizó con éxito para determinar que Grc3 puede utilizar cualquier NTP para la actividad de transferencia de fósforo, pero favorece ATP24. Este protocolo adapta el ensayo original para medir la actividad PNK de Grc3 en una imitación de ARN de su sustrato de ARN pre-ribosomal (SC-ITS2, Tabla 1). Un aspecto desafiante de este enfoque basado en la fluorescencia es la dependencia de grandes geles de poliacrilamida para resolver eficazmente los sustratos fosforilados y no fosforilados. El protocolo proporciona detalles específicos sobre cómo verter estos geles grandes y evitar escollos comunes al hacerlo.
Trabajar con ARN requiere un cuidado especial porque es muy susceptible a la degradación. Hay medidas preventivas simples que uno puede tomar para limitar la contaminación por ribonucleasa. Una estación de trabajo de ARN independiente que se puede tratar fácilmente con un agente limpiador que contiene inhibidores de la ARNa a menudo es útil. Es necesario usar siempre guantes cuando se manejen muestras y se utilicen consumibles certificados sin RNase. Debido a que el agua es otra fuente común de contaminación, lo mejor es utilizar agua recién purificada y esterilizar todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 m.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Las quinasas de polinucleótidos (PNK) son enzimas que catalizan la fosforilación del extremo hidroxilo de 5' del ADN y los oligonucleótidos de ARN. La actividad de los PNK se puede cuantificar mediante enfoques directos o indirectos. Aquí se presenta un enfoque directo e in vitro para medir la actividad de PNK que se basa en un sustrato de oligonucleótido con etiqueta fluorescente y electroforesis de gel de poliacrilamida. Este enfoque proporciona la resolución de los productos fosforilados evitando el uso de sustratos radiomarcados. El protocolo detalla cómo configurar la reacción de fosforilación, preparar y ejecutar grandes geles de poliacrilamida, y cuantificar los productos de reacción. La parte técnicamente más difícil de este ensayo es verter y ejecutar los grandes geles de poliacrilamida; por lo tanto, se proporcionan detalles importantes para superar las dificultades comunes. Este protocolo fue optimizado para Grc3, un PNK que se ensambla en un complejo de procesamiento de ARN pre-ribosomal obligado con su socio de unión, la nucleasa Las1. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para medir la actividad de otras enzimas PNK. Además, este ensayo también se puede modificar para determinar los efectos de diferentes componentes de la reacción, como el trifosfato de nucleósidos, iones metálicos y oligonucleótidos.

Un gel de desnaturalismo representativo exitoso de una valoración de ATP con una cantidad fija del complejo Las1-Grc3 se muestra en la Figura 1. La adición de enzimas dio lugar a la escisión de ARN mediada por Las1 del sustrato de ARN SC-ITS2, lo que dio lugar a un fragmento de ARN definido (ARN C2 de 5-OH C2). Tras la adición de ATP, el fragmento de ARN C2 fue fosforilado por Grc3 PNK (5-P C2 RNA). En geles desnaturalados, el ARN fosforilado migra más r...

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Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Este método puede responder preguntas clave sobre la fosforilación del extremo cinco-prime de las moléculas de ADN o ARN por una clase especial de enzimas conocidas como polinucleótidos quinasa. La principal ventaja de esta técnica es que tiene la resolución para detectar cambios muy pequeños en los sustratos de ADN y ARN. Comience preparando las reacciones de la enzima ARN quinasa.Para cada reacción, combine un microlitro de sustrato de ARN nanomolar 500. 8,3 microlitros de 130 nanomolares últimos, GRC tres y 0,2 microlitros de cinco EDTA mililarios. Ajuste el bloque de calor a 37 grados centígrados.A continuación, mezcle 0,5 microlitros de un sub stock de ATP de la serie de concentración con una mezcla de enzimas ARN y coloque la reacción en el bloque de calor. Continúe mezclando las reacciones y colocándolas en el bloque de calor a intervalos de diez segundos. Después de una incubación de 60 minutos en el bloque de calor, apagar cada reacción espiándola con 10 microlitros de tinte de carga de urea.Realice inmediatamente análisis posteriores o almacene las reacciones en 20 grados Celsius negativos para ser analizadas en una fecha posterior. Para preparar una solución de gel de acrilamida desnaturalizadora al 15%, combine 22,5 mililitros de 40%29 premezclados a una solución de acrilamida/bis acrilamida. Seis mililitros de diez x TBE.28,8 gramos de urea. Y RNase agua libre a un volumen total de 59 mililitros. A continuación, revuelva suavemente la solución.Caliente la solución en el microondas durante 20 segundos. Revuelva e inmediatamente vuelva al microondas durante otros 20 segundos. Revuelva suavemente la solución hasta que la urea se disuelva por completo.Coloque el vaso de precipitados de vidrio en un baño de aguas poco profundas, que contiene agua fría durante cinco minutos, asegurándose de que el nivel de agua fría que rodea el vaso de precipitados de vidrio está por encima del nivel de solución dentro del vaso de precipitados de vidrio. Cuando la solución esté fría, filtre y des gasee con una unidad de filtración desechable de 0,2 micrómetros para eliminar partículas y burbujas de aire microscópicas. Lave una placa de vidrio corta y larga con agua y jabón y luego rocíe cada plato con 95% de etanol y limpie el vaso para eliminar cualquier humedad.Eleve la placa larga de la parte superior del banco colocándola encima de una caja. A continuación, coloque espaciadores de 0,4 milímetros a lo largo de los bordes largos de la placa. Poner la placa corta en la parte superior de la placa larga, asegurándose de que los bordes de la placa corta, placa larga y espaciadores están alineados.A continuación, sujete cada lado con tres abrazaderas metálicas espaciados uniformemente. Añadir 24 microlitros de TEMED a la solución de acrilamida y mezclarlo. A continuación, añadir 600 microlitros de 10%APS e inmediatamente verter la solución entre las placas de vidrio.Verter la solución de acrilamida entre el sándwich de placa de vidrio puede ser realmente difícil. Para evitar burbujas de aire, toque el sándwich de placa de vidrio mientras está vertiendo su solución. Agregue cuidadosamente un peine limpio de 32 pozos a la parte superior del sándwich de placa de vidrio.Y deje que la acrilamida se polimerice durante 30 minutos. Para ejecutar el gel, ajuste el bloque de calor a 75 grados Centígrados. Retire las abrazaderas metálicas.Y lave y seque bien el sándwich de placa de vidrio. Coloque el sándwich de placa y el aparato de gel con la placa corta mirando hacia adelante y prepare 0,5 X TBE tampón de funcionamiento mediante la combinación de 100 mililitros de 10 X TBE con 1,9 litros de agua libre RNase. Agregue 600 mililitros del tampón de funcionamiento a las cámaras superior e inferior del aparato.Retire suavemente el peine del gel y enjuague bien los pozos con una jeringa. Pre-ejecutar el gel a 50 vatios durante 30 minutos. A continuación, enjuague los pozos de nuevo.Post spin las reacciones de enfriamiento y incubarlas a 75 grados Celsius durante tres minutos. Repita el giro del pulso y cargue inmediatamente 10 microlitros de cada muestra en el gel. A continuación, ejecute el gel durante tres horas a 50 vatios.Cuando la carrera haya terminado, apague la fuente de alimentación y drene la cámara superior del aparato. Lave y seque el lado exterior del sándwich de placa de vidrio. A continuación, cúbralo con papel de aluminio y transfiételo a un escáner láser para obtener imágenes.Monte el sándwich de placa de vidrio en el escenario del escáner láser. Ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión para el suelo deseado para e imagen del gel. Aquí se muestra un gel de desnaturalismo exitoso representativo de una valoración de ATP con una cantidad fija de último complejo GRC tres.La adición de enzima dio lugar a una última escisión de ARN mediada de la Saccharomyces cerevisiae ITS dos sustrato de ARN, dando lugar a un fragmento de ARN definido. Tras la adición de ATP, el fragmento de ARN C2 fue fosforilado por GrC3 PNK. Para visualizar la fosforilación del fragmento de ARN C2, la cantidad relativa de ARN C2 sin fosforilado y fosforilado se antipentó contra la concentración de ATP.Nuestro gel de desnaturalismo sin éxito se muestra aquí. El sustrato de ARN de 21 nucleótidos contenía productos de degradación, que se superponía con el producto fosforilado e imposibilitó cuantificar con precisión la fosforilación. Por el contrario, el producto de degradación de ARN más corto podría ser analizado con éxito porque esta área del gel no contenía ninguna especie de ARN adicional que obstaculizara la cuantificación precisa de su contraparte fosforilada.Lo más importante a recordar al intentar este protocolo es enjuagar los pozos del gel para asegurar la carga uniforme de la muestra. Después de este procedimiento, se podría realizar un experimento de rotación de ARN. Para medir las tasas de degradación del ARN, la fosforilación a menudo indica el inicio de la degradación del ARN.Esta técnica allana el camino para responder preguntas detalladas sobre la especificidad de las actividades y la cinética de las quinasas de polinucleótidos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Investigación

Bioquímica

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

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Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

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Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

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Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...