Name: nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Dr. Andrew Sikkema ve Andrea Kaminski'ye bu el yazmasının eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247' den R.E.S) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR; 146626 to M.C.P).

1. Hazırlık
<ol><li>Arabellek ve reaktifleri hazırlayın.<ol>
<li>Toplam 1 m Tris (pH = 8,0), 40 μL 5 M sodyum klorür, 2,5 μL 2 M magnezyum klorür, 100 μL %50 (v/v) gliserol ve 1 mL'lik rNase içermeyen suyu birleştirerek 1x Reaksiyon Tamponu yapın.</li>
		<li>4,8 g üre, 200 μL 1 M Tris (pH = 8,0), 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL %1 (w/v) bromofenol mavisi ve RNase içermeyen suyu birleştirerek üre yükleme boyası yapın.</li>
		<li>108 g Tris baz, 55 g borik asit, 40 mL 0,5 M EDTA (pH = 8,0) ve Toplam 1 L...

<ol>
	<li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+(NiKs)+and+their+role+in+RNA+processing.">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li><li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease,+Polynucleotide+Kinase,+and+Exonuclease+Activities.">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li><li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1.">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li><li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme,+polynucleotide+kinase.">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-end+labeling+of+RNA+with+[gamma-32P]ATP+and+T4+polynucleotide+kinase.">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li><li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+labeling,+conjugation+and+ligation.">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li><li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End+labeling+procedures:+an+overview.">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li><li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase.">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li><li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase.">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li><li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli.">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li><li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse:+T4+polynucleotide+kinase.">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life.">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li><li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1.">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li><li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders.">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li><li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase:+an+RNA+repair+enzyme.">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li><li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors.">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li><li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification.">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li><li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles.">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li><li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase/phosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex/hemin+DNAzyme.">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li><li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity.">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li><li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage.">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li><li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5'--&gt;3'+exonucleases.">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'--&gt;3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li><li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex.">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li><li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes.">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li><li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+5'-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides.">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li><li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li></ol>

Tanımlanan floresan etiketli nükleotit substratlar üzerinde Grc3 PNK kinaz aktivitesini ölçmek için bir töz. Bu protokol Reaksiyon Tamponu ve oligonükleotid substratuyarlayarak diğer PNK enzimlerini karakterize etmek için uygulanabilir. Örneğin, protokol EDTA bir izleme miktarı için çağırır. EDTA eklenmesi iki nedenden dolayı yararlıdır: Birincisi, bu yaklaşım karışımı kirlenmiş metallerin eser miktarda enzim bağlanmasını engelleyerek magnezyum bağlı Grc3 lehine. İkinci olarak, az miktar...

Polinükleotid kinazlar (PNK) DNA onarımı ve,ribozom montaj1,2,3,4,5gibi birçok DNA ve RNA işleme yollarında kritik rol oynamaktadır., Bu temel enzimler terminal (gama) monofosfatının nükleozit trifosfattan (NTP, en sık ATP) nükleotit substratının 5' hidroksil ucuna transferini katalizler. En iyi karakterize PNKs biri bakteriyofaj T4 PNK, geniş substrat özgüllüğü vardır ve ağır bir DNA veya RNA substrat5terminus üzerine radyoaktif izotop etiketleri dahil etmek için moleküler biyoloji laboratuvarları tarafından kullanılan 6,7,8,9,10,11,12. Bir PNK enziminin başka bir örneği CLP1, Eukarya bulunan, Eubacteria, ve Arke, ve çeşitli RNA işleme yollarıkarıştığı 4,13,14,15.
Tarihsel olarak, polinükleotid kizaz aktivitesiölçmek en tahliller radyoaktif izotop etiketleme ve sonraki otoradyografi5,bağlıdır ,16. Son yıllarda ek tahliller bir dizi pnk aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir, tek molekül yaklaşımları da dahil olmak üzere, mikroçip elektroforez, moleküler işaretleri, yanı sıra kolorimetrik ve parlaklık tabanlı tahliller17,18,19,20,21,22. Bu yeni yaklaşımların çoğu gelişmiş algılama limitleri sağlarken ve radyoaktivite kullanımını önlemek, her maliyet gibi dezavantajları vardır, immobilize reçine güven, ve substrat seçiminde sınırlamalar.
Grc3 pre-ribozomal RNA2,,,3,23işlenmesinde önemli bir rol oynayan bir polinükleotid kinaz olduğunu. Grc3 endoribonuclease Las1 ile zorunlu bir kompleks oluşturur, hangi iç Transkripsiyonu Spacer cleaves 2 (ITS2) pre-ribozomal RNA3. Las1 tarafından ITS2 dekolte daha sonra Grc3 kinizaz3tarafından fosforile bir 5 'hidroksil barındıran bir ürün üretir. Grc3'ün nükleotit ve substrat özgüllüğünü araştırmak için, farklı oligonükleotid substratlarının test edilmesine izin veren ucuz bir test gerekiyordu. Bu nedenle floresan etiketli substratlar kullanılarak PNK fosforilasyon titreti geliştirilmiştir. Bu tsur, Grc3'ün fosforil transfer aktivitesi için herhangi bir NTP kullanabileceğini belirlemek için başarıyla kullanıldı, ancak ATP24'ünlehine. Bu protokol, grc3'ün pnk aktivitesini, ribozomal RNA substratının bir RNA mimiküzerinde ölçmek için orijinal testini uyarlar (SC-ITS2, Tablo 1). Bu floresan tabanlı yaklaşımın zorlu bir yönü fosforlu ve fosforile olmayan yüzeyleri etkili bir şekilde çözmek için büyük poliakrilamid jeller güven. Protokol, bu büyük jellerin nasıl döküleceklerine ve bunu yaparken ortak tuzaklardan nasıl kaçınılacaklarına dair özel ayrıntılar sağlar.
RNA ile çalışmak, bozulmaya karşı güçlü bir şekilde duyarlı olduğu için özel bir bakım gerektirir. Ribonükleaz kontaminasyonunu sınırlamak için atabileceğiniz basit önleyici adımlar vardır. RNase inhibitörü içeren bir temizlik maddesi ile kolayca tedavi edilebilen ayrı bir RNA iş istasyonu genellikle yararlıdır. Numuneleri işlerken her zaman eldiven takmak ve RNase içermeyen sertifikalı sarf malzemelerinin kullanılması gereklidir. Su başka bir yaygın kontaminasyon kaynağı olduğundan, taze arıtılmış su kullanmak ve 0,22 μm filtre kullanarak tüm çözümleri sterilize etmek en iyisidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mm 34-well comb</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm spacer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA ph 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 8.0</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution 29:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1188K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SQ3 Sequencer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled RNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacia EPS 3500 Power Supply</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip 0. 22 um Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5FCP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 9500 gel imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure DEPC Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19E1056865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>U15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nonradioactive assay to measure polynucleotide phosphorylation of small nucleotide substrates

Polinükleotid kinazlar (PNKs) DNA ve RNA oligonükleotidlerinin 5' hidroksil ucunun fosforilasyonını katalize eden enzimlerdir. PNK'ların etkinliği doğrudan veya dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ölçülebilir. Burada sunulan bir floresan etiketli oligonükleotid substrat ve poliakrilamid jel elektroforez dayanan PNK aktivitesini ölçmek için doğrudan, in vitro bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, fosforlu ürünlerin çözünürlüğünü sağlarken, radyoetiketli yüzeylerin kullanımından kaçınılır. Protokol, fosforilasyon reaksiyonu nasıl ayarlanacağını, büyük poliakrilamid jellerinin nasıl hazırlanacağını ve çalıştırılabildiğini ve reaksiyon ürünlerinin nasıl ölçülmesini ayrıntılarıyla anlatır. Bu sataşma en teknik olarak zorlu kısmı dökülen ve büyük poliakrilamid jelleri çalışan; böylece, ortak zorlukların üstesinden gelmek için önemli ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu protokol Grc3 için optimize edildi, bağlayıcı ortağı ile zorunlu bir pre-ribozomal RNA işleme kompleksi içine monte bir PNK, Las1 nükleaz. Ancak, bu protokol diğer PNK enzimlerinin aktivitesini ölçmek için uyarlanabilir. Ayrıca, bu tetkik de reaksiyonun farklı bileşenlerinin etkilerini belirlemek için değiştirilebilir, nükleozit trifosfat gibi, metal iyonları, ve oligonükleotidler.

Sabit miktarda Las1-Grc3 kompleksi bulunan ATP titrasyonunun jelini inkar eden başarılı bir temsilci Şekil 1'degösterilmiştir. Enzimin eklenmesi, SC-ITS2 RNA substratının Las1 aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına (5-OH C2 RNA) yol açtı. ATP'nin eklenmesi yle C2 RNA parçası Grc3 PNK (5-P C2 RNA) tarafından fosforlandı. Denaturing jellerde fosforilasyonlu RNA fosforlu olmayan muadili daha hızlı göç ed...

Watch this Scientific Journal Video about Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates at JoVE.com

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Bu yöntem, DNA veya RNA moleküllerinin beş asal ucunun fosforilasyonuna ilişkin anahtar soruları polinükleotid kinaz olarak bilinen özel bir enzim sınıfı ile yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, DNA ve RNA yüzeylerinde çok küçük değişiklikleri tespit etme çözünürlüğüne sahip olmasıdır. RNA enzimkinaz reaksiyonlarını hazırlayarak başlayın.Her reaksiyon için, 500 nanomolar RNA substrat bir mikrolitre birleştirin. 8.3 mikrolitre 130 nanomolar son bir, GRC üç ve beş milimolar EDTA 0.2 mikrolitre. Isı bloğunu 37 dereceye ayarlayın.Daha sonra konsantrasyon serisinden bir ATP alt stokunun 0,5 mikrolitresini bir RNA enzim karışımıyla karıştırın ve reaksiyonu ısı bloğuna yerleştirin. Reaksiyonları karıştırmaya ve on saniye aralıklarla ısı bloğuna yerleştirmeye devam edin. Isı bloğunda 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her reaksiyonu 10 mikrolitre üre yükleme boyası ile şişirerek söndürün.Hemen aşağı analizi gerçekleştirmek veya negatif 20 santigrat derece daha sonraki bir tarihte analiz edilecek reaksiyonlar saklayın. %15 denaturing akrilamid jel çözeltisi hazırlamak için, 22,5 mililitre önceden karıştırılmış 40%29 ile bir akrilamid/bis akrilamid çözeltisini birleştirin. On x TBE altı mililitre.28.8 gram üre. Ve toplam 59 mililitre lik bir hacimde serbest su layın. Sonra yavaşça çözüm karıştırın.Çözeltiyi mikrodalgafırında 20 saniye ısıtın. Karıştırın ve hemen başka bir 20 saniye için mikrodalga geri dönün. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi hafifçe karıştırın.Cam kabı, cam kabıçevreleyen soğuk su seviyesinin cam kabın içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olmak için beş dakika boyunca soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirin. Çözelti soğuduğunda, partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını temizlemek için 0,2 mikrometrelik tek kullanımlık filtrasyon ünitesi ile filtreleyin ve gazdan arındırın. Kısa ve uzun cam bir tabağı sabun ve suyla yıkayın ve her tabayı %95 etanol ile püskürtün ve nemi gidermek için camı silin.Uzun plakayı bir kutunun üzerine koyarak yedek tezgahın üstünden yükseltin. Daha sonra plakanın uzun kenarları boyunca 0,4 milimetrelik boşlukkonumlandırın. Kısa plakayı uzun plakanın üzerine yerleştirin, kısa plakanın kenarlarının, uzun plakanın ve boşluklayıcıların hizalandığından emin olun.Daha sonra her iki tarafı üç eşit aralıklı metal kelepçeyle kelepçele. Akrilamid çözeltisine 24 mikrolitre TEMED ekleyin ve karıştırın. Sonra% 10 APS 600 mikrolitre ekleyin ve hemen cam plakalar arasında çözüm dökün.Cam plakalı sandviç arasına akrilamid çözeltisi dökmek gerçekten zor olabilir. Hava kabarcıkları önlemek için, çözüm dökerken cam plakalı sandviç dokunun. Dikkatle cam tabak sandviç üstüne temiz bir 32-well tarak ekleyin.Ve akrilamidin 30 dakika polimerleşmesine izin verin. Jelçalıştırmak için, 75 santigrat derece ısı bloğu ayarlayın. Metal kelepçeleri çıkarın.Ve iyice yıkayın ve cam tabak sandviç kuru. Plakalı sandviçi ve jel aparatı ile kısa plakayı öne bakacak şekilde yerleştirin ve 10 X TBE'nin 100 mililitresini 1,9 litre RNase serbest su ile birleştirerek 0,5 X TBE çalışan tampon hazırlayın. Cihazın üst ve alt odalarına çalışan tampon 600 mililitre ekleyin.Taraktan yavaşça çıkarve kuyuları bir şırınga ile iyice durulayın. Jeli 30 dakika boyunca 50 Watt'ta önceden çalıştırın. Sonra kuyuları tekrar durulayın.Post söndürme reaksiyonları spin ve üç dakika boyunca 75 santigrat derece onları kuluçka. Darbe dönüşünü tekrarlayın ve her numunenin 10 mikrolitresini hemen jelüzerine yükleyin. Sonra 50 Watt'ta jeli üç saat çalıştırın.Çalışma bittiğinde, güç kaynağını kapatın ve cihazın üst haznesini boşaltın. Cam plakalı sandviçin dış tarafını yıkayın ve kurutun. Sonra folyo ile kaplayın ve görüntüleme için bir lazer tarayıcı aktarın.Cam plakalı sandviçi lazer tarayıcının sahnesine monte edin. İstenilen zemin için uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın ve jeli görüntüleyin. Burada gösterilen son bir GRC üç karmaşık sabit bir miktar ile ATP bir titrasyon temsilcisi başarılı denaturing jel.Enzimin eklenmesi, Saccharomyces cerevisiae ITS iki RNA substratının son bir aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına yol açtı. ATP'nin eklenmesiyle C2 RNA parçası GrC3 PNK tarafından fosforlandı. C2 RNA parçasının fosforilasyonunu görselleştirmek için, göreceli miktarda fosforilasyonsuz ve fosforlu C2 RNA ATP konsantrasyonuna karşı çizilmiştir.Temsilcimiz başarısız denaturing jel burada gösterilmiştir. 21 nükleotit RNA substratı, fosforilasyonlu ürünle örtüşen ve fosforilasyonun doğru bir şekilde ölçülmesini imkansız hale getiren bozunma ürünleri içeriyordu. Buna karşılık, jelin bu alanı fosforlu muadili doğru nicelliği engelleyen herhangi bir ek RNA türü içermediğinden, en kısa RNA bozunma ürünü başarıyla analiz edilebilir.Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, numunenizin eşit şekilde yüklendiğinden emin olmak için jel kuyularını durulamaktır. Bu yordamı takiben bir RNA ciro deneyi yapılabilir. RNA bozulma oranlarını ölçmek için, fosforilasyon genellikle RNA bozulmasının başlatılmasını işaretler.Bu teknik, polinükleotid kinazların aktivite özgüllüğü ve kinetikleri hakkında ayrıntılı soruların cevaplanmasının önünü açmektedir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...