このプロトコルは、固相マイクロ抽出繊維を使用してサーバー内または横にある脳腫瘍からの抽出を行うために使用することができる。この技術は、切除された腫瘍から直接小分子を抽出することを可能にし、分析機器に直接抽出装置を結合することによって、迅速な術中診断の機会を提供する。固相微小抽出装置を調製するために、各固相微小抽出装置プローブの符号化を混合モードまたはC18コーティングで、腫瘍の大きさに応じて適当な長さにトリミングする。
そして、プローブと50 50メタノール水溶液をサンプル採取前に少なくとも1時間浸漬する。このプロトコルは脳腫瘍に焦点を当てていますが、戦略は多くの異なる癌の診断のために実装することができます。この技術は完全にポータブルであるため、追加のデバイスは必要ありません。
腫瘍除去後できるだけ早く、LCMSグレードの水でプローブ繊維を5秒間浸漬してから、脳腫瘍組織サンプルにできるだけ遠く繊維を挿入し、抽出段階全体が腫瘍の内側に位置することを確認する。検体腫瘍以外のソースからのアーティファクトの存在によるエラー源を排除するために、正確に30分間組織内にプローブを残し、同じ期間テーブルに条件プローブ繊維を置く。抽出の間、抽出後のプローブ貯蔵に使用されるラベルHPLCバイアル。
抽出の最後に、繊維をLCMSグレードの水に3秒間浸漬して血液または細胞の破片を除去し、各プローブを単一のHPLCバイアルキャップのセプタの底部に挿入して繊維を固定化します。その後、固定化された繊維でバイアルをキャップし、適切な輸送コンテナにバイアルを配置します。実験室到着時に、すぐにそれぞれ3〜5年以下のマイナス30またはマイナス80度の冷凍庫にバイアルを置いた。
1回の実験からすべてのサンプルを採取したら、混合モード繊維を含むバイアルを室温に置きます。そして、脱着のための2ミリリットルバイアルにラベルを付け、各バイアルにガラスインサートを入れ、各インサートに作りたての80 20アセトニトリル水溶液の300マイクロリットルを追加します。各プローブのコードを脱離溶媒の個々のバイアルに完全に浸漬し、渦の1,200回転で1分あたり120分間バイアルを攪拌する。
脱着が完了したら、バイアルからキャップを取り出し、腫瘍からの抽出物を含む各ファイルから10マイクロリットルのアリコートを取り除き、品質管理サンプルを調製します。次に、バイアルを新しいキャップで閉じ、バイアルを液体クロマトグラフィーの高分解能質量分析計の4°Cオートサンプラーに入れます。リピドミック分析用のサンプルを調製するには、C 18繊維を含むバイアルを室温に置き、2ミリリットルのHPLCバイアルにラセレートしたガラス挿入物をバイアルに挿入し、各挿入に200マイクロリットルの新鮮な準備をした50 50イソプロパノールメタノール溶液を加えます。
各プローブコーティングを溶媒に完全に浸し、渦で毎分1,200回転で50分間攪拌します。時間の終わりに、キャップを取り除くことによって脱着を停止し、腫瘍からの抽出物を含む各ファイルから10マイクロリットルのアリコートを取っておき、品質管理サンプルを準備し、バイアルを新しいキャップで閉じます。次に、バイアルを液体クロマトグラフィーの4°Cオートサンプラーに入れ、高分解能質量分析計を行います。
主成分分析プロット上の品質管理サンプルの緊密なクラスタリングに基づいて、器械分析の再現性が非常に良好であると判断された。神経膠腫および髄膜腫患者から採取されたサンプルに関するこれらのリピドミクスデータは、腫瘍サンプルが組織学的起源および悪性腫瘍に応じて区別される能力を強調する。これらのメタボロミクスデータで示されるように、グリオーマは、悪性度の程度に基づいてさらに分割することができ、または、対象の突然変異の有無に応じて。
統計分析では、研究対象グループ内の特定の化合物の選択も可能です。抽出時間を注意深く制御し、すべてのサンプルの再現可能な条件を維持することが不可欠です。あるいは、サンプルをクロマトグラフィー分離なしで直接Msに溶解させることができ、特定のマーカーの標的分析を可能にし、手順全体を数分に短縮することができます。
