Name: imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Paula Monsma pour l’instruction et l’aide à la microscopie confocale et à la dissection des nerfs tibiaux et au Dr Atsuko Uchida, Chloe Dugre et Sana Chahandele pour leur aide pour l’élevage de souris. Ce travail a été soutenu en partie par la collaboration De la National Science Foundation Grants IOS1656784 à A.B. et IOS1656765 à P.J., et national Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 et S10 OD010383 à A.B. N.P.B. a été soutenu par une bourse de l’Ohio State University President’s Postdoctoral Scholars Program.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État de l’Ohio.
1. Préparation de la solution saline nerveuse
<ol><li>Faire 100 mL de la solution saline de Breuer10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glucose, 23,8 mM NaHCO3 dans de l’eau double distillée.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons.">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li><li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Axonal+Transport.">Slow Axonal Transport.</a> Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).</li><li>Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses.">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li><li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons.">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li><li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons.">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li><li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells.">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li><li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier.">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li><li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method.">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis.">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li><li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes.">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li><li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes.">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li><li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival.">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).</li><li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images.">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li><li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD(P)H+and+flavoprotein.">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li><li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics.">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li><li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses.">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li><li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons.">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li><li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve.">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).</li><li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+size+index:+d.">The effect size index: d.</a> Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo.">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li><li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+"P301L"+tau+knockin+mouse.">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li><li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li><li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability.">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li></ol>

Il faut faire attention à l’analyse des expériences d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions, car il existe un risque important d’introduction d’erreurs pendant le post-traitement, principalement pendant la correction du champ plat, l’alignement de l’image et la correction de l’eau de Javel. La correction de champ plat est nécessaire pour corriger la non-uniformité dans l’éclairage, ce qui entraîne une chute de l’intensité à travers le champ de vision du centre à la périph...

Le transport axonal des neurofilaments a été démontré pour la première fois dans les années 1970 par l’étiquetage radioisotopique1. Cette approche a donné une mine d’informations sur le transport neurofilament in vivo, mais il a relativement faible résolution spatiale et temporelle, généralement de l’ordre des millimètres et des jours au mieux2. De plus, l’étiquetage radioisotopique des impulsions est une approche indirecte qui nécessite l’injection et le sacrifice de plusieurs animaux pour générer un cours unique. Avec la découverte de protéines fluorescentes et les progrès de la microscopie de fluorescence dans les années 1990, il est devenu par la suite possible d’imager le transport de neurofilament directement dans les neurones cultivés sur une échelle de temps de secondes ou de minutes et avec une résolution spatiale sous-micrométrique, offrant une compréhension beaucoup plus grande du mécanisme du mouvement3. Ces études ont révélé que les polymères neurofilament dans les axones se déplacent rapidement et par intermittence dans les deux directions antérogrades et rétrogrades le long des voies de microtubule, propulsés par des protéines motrices microtubules. Cependant, les neurofilaments sont des structures limitées par la diffraction à seulement 10 nm de diamètre qui sont généralement espacées de leurs voisins par seulement des dizaines de nanomètres; par conséquent, les polymères ne peuvent être suivis que dans les neurones cultivés qui contiennent des neurofilaments peu distribués afin que les polymères en mouvement puissent être résolus à partir de leurs voisins4. Ainsi, il n’est pas actuellement possible de suivre les neurofilaments simples dans les axones qui contiennent des polymères neurofilament abondants, tels que les axones myélins.
Pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones riches en neurofilament à l’aide de la microscopie de fluorescence, nous utilisons une méthode de photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion que nous avons développée pour étudier le comportement de pause à long terme des neurofilaments dans les cellules nerveuses cultivées4,5. Les neurofilaments marqués avec une protéine de fusion de neurofilament fluorescent photoactivatable sont activés dans un court segment d’axone, puis le taux de départ de ces filaments de la région activée est quantifié en mesurant la décomposition de fluorescence au fil du temps. L’avantage de cette approche est qu’il s’agit d’une analyse au niveau de la population du transport neurofilament qui peut être appliquée sur une échelle de temps de minutes ou d’heures sans avoir besoin de suivre le mouvement des polymères neurofilament individuels. Par exemple, nous avons utilisé cette méthode pour analyser la cinétique du transport neurofilament dans les cultures myélinantes6.
Récemment, nous avons décrit le développement d’une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime de faibles niveaux d’une protéine de neurofilament pagFP-marquée M (paGFP-NFM) dans les neurones sous le contrôle du neurone humain spécifique Thy1 promoteur7. Cette souris permet l’analyse du transport de neurofilament in situ à l’aide de la microscopie de fluorescence. Dans cet article, nous décrivons les approches expérimentales pour analyser le transport de neurofilament dans les axones myélinés des nerfs tibiaux de ces souris utilisant deux approches. La première de ces approches est la méthode d’évacuation des impulsions décrite ci-dessus. Cette méthode peut générer des informations sur le comportement de pause des neurofilaments, mais est aveugle à la direction dans laquelle les filaments quittent la région activée, et ne permet donc pas la mesure de la directionnalité nette et la vitesse de transport8. La deuxième de ces approches est une nouvelle méthode de propagation des impulsions dans laquelle nous analysons non seulement la perte de fluorescence de la région activée, mais aussi l’augmentation transitoire de la fluorescence dans deux fenêtres latérales par lesquelles les filaments fluorescents se déplacent à mesure qu’ils quittent la région activée dans les deux directions antérogrades et rétrogrades. Dans les deux approches, les paramètres du transport de neurofilament tels que la vitesse moyenne, la directionnalité nette et le comportement de pause peuvent être obtenus en utilisant l’analyse mathématique et la modélisation des changements dans la fluorescence dans les fenêtres de mesure. La figure 3 illustre ces deux approches.
Ce protocole démontre la dissection et la préparation du nerf, l’activation et l’imagerie de la fluorescence paGFP, et la quantification du transport de neurofilament à partir des images acquises à l’aide du paquet de distribution FIJI d’ImageJ9. Nous utilisons le nerf tibial parce qu’il est long (plusieurs cm) et ne se ramifie pas; cependant, en principe tout nerf exprimant paGFP-NFM est approprié pour une utilisation avec cette technique si elle peut être disséquée et désaissée sans endommager les axones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>1907-1422-100</td>
			<td>inner gasket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Round Gasket w/ Holes</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>1907-08-750</td>
			<td>outer gasket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10mm dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>153066</td>
			<td>dissection dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40mm round coverslips</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>40-1313-0319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL syringe - Luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Revolution WD spinning-disk confocal system</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>for fluorescein slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>fine tipped forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>47 50 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pan with wax</td>
			<td>Ginsberg Scientific</td>
			<td>568859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>initial dissection scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS2 perfusion chamber</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH27-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminectomy forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>initial dissection forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microaqueduct slide</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>130119-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td>for fluorescein slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage insert</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>I-3017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Oko Touch with objective collar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective oil - type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodoacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Sage Instruments</td>
			<td>Model 355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing adapter - female</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>1005109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing adapter - male</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>1005012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td></td>
			<td>1/16&#34; ID, 1/32&#34; wall thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve

Les polymères protéiques neurofilaments se déplacent le long des axones dans la composante lente du transport axonal à des vitesses moyennes de ~0,35-3,5 mm/jour. Jusqu’à récemment, l’étude de ce mouvement in situ n’était possible qu’à l’aide de l’étiquetage radioisotopique des impulsions, ce qui permet l’analyse du transport axonal dans des nerfs entiers avec une résolution temporelle des jours et une résolution spatiale de millimètres. Pour étudier le transport de neurofilament in situ avec une résolution temporelle et spatiale plus élevée, nous avons développé une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime la protéine de neurofilament M marquée avec le GFP photoactivatable dans les neurones. Ici, nous décrivons la photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion et les méthodes de propagation des impulsions pour analyser le transport neurofilament dans les axones myélins uniques des nerfs tibiaux de ces souris ex vivo. Les segments nerveux isolés sont maintenus au stade du microscope par perfusion avec saline oxygénée et photographiés par la microscopie confocale de fluorescence de disque tournant. La lumière violette est utilisée pour activer la fluorescence dans une courte fenêtre axonale. La fluorescence dans les régions activées et flanquantes est analysée au fil du temps, permettant l’étude du transport de neurofilament avec résolution temporelle et spatiale de l’ordre des minutes et des microns, respectivement. La modélisation mathématique peut être utilisée pour extraire les paramètres cinétiques du transport neurofilament, y compris la vitesse, le biais directionnel et le comportement de pause des données résultantes. Les méthodes d’évacuation des impulsions et de propagation du pouls peuvent également être adaptées pour visualiser le transport de neurofilament dans d’autres nerfs. Avec le développement de souris transgéniques supplémentaires, ces méthodes pourraient également être utilisées pour l’image et l’analyse du transport axonal d’autres protéines cytosquelettiques et cytosoliques dans les axones.

La figure 3 montre des images représentatives d’expériences d’évacuation par impulsion et de propagation d’impulsions. Nous avons publié plusieurs études qui décrivent les données obtenues à l’aide de la méthode d’évacuation des impulsions et de nos méthodes d’analyse de ces données5,6,7,8,17. Ci-dessous, n...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve at JoVE.com

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Ce protocole permet l’imagerie directe de la population de neurofilaments chez les axones myélinés de souris juvéniles ou adultes à l’aide d’une microscopie de fluorescence, ce qui permet de mesurer la directionnalité et la vitesse du transport du neurofilament dans des segments nerveux isolés. Cette méthode dépend de la disponibilité de souris exprimant une fusion fluorescente photoactivatable de la protéine d’intérêt, mais peut être adaptée pour une utilisation dans n’importe quel nerf facilement disséqué. Pour commencer, versez la solution saline oxygénée dans une seringue de 60 millilitres et assurez-vous qu’il reste un minimum d’air dans la seringue.Connectez la seringue au tube, puis placez le tube de sortie dans un flacon de déchets. Placez le joint extérieur dans le boîtier de la chambre de perfusion, en veillant à ce que l’entrée d’écoulement et les poteaux de sortie soient alignés avec les trous dans le joint, puis mentez le joint intérieur sur un couvercle circulaire numéro 1.5 et lissez soigneusement toutes les rides dans le joint pour assurer un joint serré. Placez le coverslip et le joint sur une serviette en papier ou un chiffon de tâche avec le joint faisant face vers le haut.Utilisez une paire de gros ciseaux de dissection pour faire une incision dorsale dans la peau près du milieu de la colonne vertébrale et continuer à couper autour de l’aspect ventral de l’animal. Tirez lentement la peau loin du muscle et coupez le fascia. Ensuite, utilisez des ciseaux de microdissection pour faire une incision dans les muscles de la cuisse à mi-chemin entre la queue et le genou pour exposer le nerf sciatique.Assurez-vous que le nerf, qui est visible à travers le muscle, n’est pas coupé. Étendre l’incision dorsalement et ventrally pour enlever le muscle, puis enlever les muscles du mollet, en gardant les coupes peu profondes et courtes pour éviter d’endommager les nerfs. Continuez à enlever les muscles jusqu’à ce que le nerf tibial soit complètement exposé à partir du point où il se ramifie du nerf sciatique au talon.Saisissez le nerf tibial à l’extrémité proximale de la colonne vertébrale avec une paire de forceps et coupez-le avec une paire de ciseaux de microdissection, en vous assurant de ne pas appliquer trop de tension sur le nerf. Soulevez-le soigneusement loin du muscle et coupez les attaches, en prenant soin de ne pas mettre de tension sur le nerf. Couper l’extrémité distale de la colonne vertébrale du nerf tibial et le transférer dans une petite boîte de Pétri de température ambiante oxygénée saline.À partir de l’extrémité proximale du nerf, saisir doucement les extrémités exposées de l’axon avec une paire de forceps pointe très fine. Avec une deuxième paire de forceps, saisir la gaine nerveuse proximalement et lentement tirer vers l’extrémité distale du nerf en s’assurant qu’aucune tension indue n’est appliquée au cours de ce processus. Saisissez l’extrémité proximale du nerf et ez-le lentement sur un coverslip, puis redressez-le sous une tension douce.Placez la glissade du microaqueduct sur le nerf avec la glissière rainurée vers le bas et placez la direction de l’écoulement parallèle au nerf. Retournez le coverslip et l’assemblage des microaqueducts et placez-le dans le boîtier de la chambre de perfusion avec la glissière opposée au joint extérieur. Pour fixer la chambre de profusion, placez-la dans le boîtier métallique et faites pivoter l’anneau de verrouillage.Déprimez lentement le piston salin de seringue et remplissez la chambre de perfusion. Gardez l’entrée et le tube de sortie, le flacon de sortie et la seringue surélevés au-dessus de la chambre elle-même en tout temps pendant la configuration et l’imagerie. Transférer l’assemblage de profusion à un stade de microscope inversé et monter la seringue saline dans la pompe à seringues, puis démarrer le moteur et ajuster la vitesse pour un débit de 0,25 millilitres par minute.Connectez le chauffe-solution en ligne et réglez-le à 37 degrés Celsius. Connectez le chauffe-eau objectif et réglez-le à 37 degrés Celsius. Appliquer de l’huile sur l’objectif et insérer la chambre de profusion dans la monture de scène.Appliquez de l’huile sur le coussin chauffant de chambre et fixez-la à la chambre de perfusion, puis connectez-la et réglez-la à 37 degrés Celsius. Verrouillez la chambre de profusion dans l’adaptateur de scène et mettre l’huile objective en contact avec le coverslip sur le dessous de la chambre. Utilisez l’éclairage Brightfield pour vous concentrer sur la couche d’axones sur la surface inférieure du nerf le plus proche de la surface du coverslip.Les axones myélinés peuvent être identifiés par la présence d’une gaine de myéline qui est visible sous l’éclairage lumineux transmis par Brightfield sans amélioration du contraste. Acquérir une image de référence Brightfield, enregistrer la directionnalité du nerf, puis acquérir une image confoccale à l’aide d’un laser de 488 nanomètres et un filtre d’émission approprié pour gfp photoactivatable. Réglez la puissance laser à environ cinq fois la puissance normale d’imagerie et d’acquérir une image avec un temps d’exposition de trois à quatre minutes, puis acquérir une autre image confocale pour enregistrer l’autofluorescence pré-activation après l’étape de blanchiment.Tracez une ligne parallèle aux axones avec une longueur égale à la taille de fenêtre d’activation désirée de l’image Brightfield. En utilisant cette ligne comme guide, dessinez une région rectangulaire d’intérêt à travers le champ de vision perpendiculaire aux axones. Activez la fluorescence GFP dans cette région par excitation de modèle avec la lumière de 405 nanomètres, en s’assurant qu’une image est acquise juste avant et immédiatement après l’activation.À la fin de l’activation, démarrez une minuterie d’une minuterie. Quand il s’éteint, commencer l’acquisition d’une série timelapse. Ajouter 250 milligrammes de poudre de fluorescéine à 0,5 millilitres d’eau distillée double et mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de particules visibles, puis faire tourner la solution pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour sédimenter tout matériau non dissous.Ajouter huit microlitres de solution de fluorescéine à une diapositive et appliquer un numéro 1.5 coverslip. Éponger l’excès de liquide, sceller le coverslip avec du vernis à ongles et laisser sécher la toboggan. Placez le côté coverslip de glissement vers le bas sur le stade inversé de microscope et ajustez l’accent sur le plan mince de fluorescence à la surface du coverslip.Déplacez la diapositive pour trouver un champ de vision qui ne contient pas de bulles d’air ou de grosses particules de fluorescéine et d’acquérir une pile Z couvrant six micromètres à intervalles de 0,2 micromètre de sorte que l’image du milieu est le plan de mise au point d’origine. Fermez tous les volets de chemin lumineux, y compris l’obturateur de la caméra et réglez la puissance laser et le temps d’exposition à zéro seconde. Acquérir une pile de 100 images avec ces paramètres, qui seront en moyenne pour générer l’image du champ sombre.Des images représentatives d’expériences d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions sont présentées ici. Pour la méthode d’évacuation des impulsions, la cinétique de désintégration de fluorescence dans la région activée peut fournir des informations sur le comportement d’arrêt à long terme et à court terme. La région activée peut être courte pour ces expériences.Une région activée plus longue est utilisée pour la méthode de propagation des impulsions afin de fournir un plus grand bassin de neurofilaments fluorescents. Cela allonge le temps pendant lequel l’augmentation de la fluorescence dans les régions flanquées reste linéaire. 15 micromètres flanquant des fenêtres sont utilisés ici.La fluorescence totale de la fenêtre de mesure a été quantifiée. La désintégration est biphasique pour la méthode d’évacuation des impulsions avec une décomposition exponentielle initiale représentant le départ des neurofilaments sur piste et une deuxième pourriture exponentielle plus lente à 10 à 20 minutes qui représente le départ des filaments hors piste. Pour la stratégie de propagation des impulsions, les calculs de la vitesse et de la directionnalité du mouvement ne dépendent que des pentes des fenêtres latérales.Pour les longueurs de fenêtre utilisées ici, la phase linéaire s’étend sur environ cinq minutes. Un timelapse d’un nerf glycolytiquement inhibé est montré ici, démontrant une réduction apparente du transport hors de la région activée. En effet, les pentes distales et proximales sont significativement plus faibles dans les nerfs traités avec l’inhibiteur.Il y a également une diminution significative de la vitesse de population entre ces deux conditions. Lorsque vous essayez ce protocole, rappelez-vous qu’il est crucial d’être hâtif dans la conduite de la dissection et des parties d’assemblage de chambre que la santé nerveuse diminue après le sacrifice de l’animal. La culture cellulaire neuronale peut permettre la mesure et l’analyse du mouvement des neurofilaments individuels, ce qui compléterait les données à l’échelle de la population recueillies à l’aide de ce protocole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Culture organotypique d&#39;exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d&#39;excroissance des nerfs périphériques

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Recherche

Neurosciences

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

In Vivo Imagerie multimodale et analyse du modèle de néovascularisation choroïdienne souris induite par Laser

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...