Name: imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00
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저자는 공초점 현미경 검사법과 정경 신경 해부와 박사 아츠코 우치다, 클로이 듀거와 사나 차한데 마우스 축산에 대한 도움을 폴라 몬스마에 감사드립니다. 이 작품은 A.B에 공동 국가 과학 재단 보조금 IOS1656784에 의해 부분적으로 지원되었다. 그리고 IOS1656765 에 P.J., 및 건강 보조금 R01 NS038526, P30 NS104177 및 S10 OD010383 에 A.B. N.P.B. 오하이오 주립 대학 총장의 박사 후 학자 프로그램에서 펠로우십에 의해 지원되었다.

여기에 설명 된 모든 방법은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 신경 식염수 용액의 준비
<ol><li>브루어의 식염수100mL만들기 : 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4,1 mM MgSO4,1.5 mM CaCl2,5.6 % D-포도당, 23.8 mM NaHCO3 을 이중 증류수로 만듭니다.</li>
	<li>사용 전 30분 이상 식염수 용액을...

<ol>
	<li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons.">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li><li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Axonal+Transport.">Slow Axonal Transport.</a> Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).</li><li>Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses.">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li><li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons.">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li><li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons.">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li><li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells.">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li><li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier.">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li><li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method.">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis.">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li><li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes.">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li><li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes.">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li><li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival.">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).</li><li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images.">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li><li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD(P)H+and+flavoprotein.">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li><li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics.">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li><li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses.">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li><li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons.">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li><li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve.">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).</li><li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+size+index:+d.">The effect size index: d.</a> Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo.">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li><li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+"P301L"+tau+knockin+mouse.">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li><li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li><li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability.">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li></ol>

주로 평평한 필드 보정, 이미지 정렬 및 표백제 교정 중에 후처리 중에 오류가 발생할 가능성이 크므로 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 분석에 주의를 기울여야 합니다. 평지 보정은 조명의 비 균일성을 보정하는 데 필요하며, 이로 인해 중심에서 주변까지 시야 를 가로질러 강도가 떨어집니다. 비균일성의 정도는 파장에 의존하므로, 항상 실험 데이터를 획득하는 데 사용되는 파장에서 수?...

신경필라멘트의 축축 전달은 1970년대에 방사성 이소성 맥박 라벨링1에의해 처음 입증되었다. 이 접근법은 생체 내에서 신경 필라멘트 수송에대한 풍부한 정보를 산출했지만, 일반적으로 밀리미터와 일의 순서에 상대적으로 낮은 공간 및 시간적 해상도를 갖는다2. 더욱이, 방사성 동위원소 펄스 라벨링은 단일 시간 과정을 생성하기 위해 여러 동물의 주사와 희생을 요구하는 간접적인 접근법이다. 1990년대에 형광성 단백질의 발견과 형광 현미경 검사법의 발전으로, 이후 초 또는 분 의 시간 척도및 서브 마이크로미터 공간 해상도로 배양 된 뉴런에서 직접 신경 필라멘트 수송을 이미지화하여 운동3의메커니즘에 훨씬 더 큰 통찰력을 제공하게되었습니다. 이러한 연구는 축축산에 신경 필라멘트 폴리머가 미세 투튜룰 모터 단백질에 의해 추진 된 마이크로 투룰 트랙을 따라 영양 및 역행 방향 모두에서 신속하고 간헐적으로 이동한다는 것을 밝혔습니다. 그러나, 신경필라멘트는 수십 나노미터에 의해 그들의 이웃에서 떨어져 일반적으로 간격을 둔 직경에 다만 10 nm의 회절 제한 구조물입니다; 따라서, 중합체는 이동 폴리머가이웃4로부터해결될 수 있도록 드물게 분산된 신경필라멘트를 포함하는 배양된 뉴런에서만 추적될 수 있다. 따라서, 골수염축산축산과 같은 풍부한 신경필라멘트 폴리머를 함유한 축축에서 단일 신경필라멘트를 추적할 수 없다.
형광 현미경을 이용한 신경필라멘트-풍부한 축산에서 신경필라멘트의 축축수송을 분석하기 위해, 배양된신경세포4,,5에서신경필라멘트의 장기 일시 중지 동작을 연구하기 위해 개발한 형광활성화 펄스-이스케이프 방법을 사용하고 있다. 광액활성 형광 성 신경필라멘트 융합 단백질로 태그된 신경필라멘트는 축종의 짧은 세그먼트에서 활성화되고, 활성화된 부위로부터의 필라멘트의 이탈 속도는 시간이 지남에 따라 형광 부패를 측정하여 정량화된다. 이 접근법의 장점은 개별 신경필라멘트 폴리머의 움직임을 추적할 필요 없이 시간 척도에 적용될 수 있는 신경필라멘트 수송의 인구 수준 분석이라는 것입니다. 예를 들어, 우리는 골수 배양6에서신경 필라멘트 수송의 운동을 분석하기 위해이 방법을 사용했다.
최근에는 인간 뉴런 특이적 Thy1 프로모터7의통제 하에 뉴런에서 paGFP 태그된 신경필라멘트 단백질 M(paGFP-NFM)의 낮은 수준을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질전환 마우스의 개발을 설명했다. 이 마우스는 형광 현미경 검사를 사용하여 시상에서 신경 필라멘트 수송의 분석을 허용합니다. 이 문서에서는, 우리는 2개의 접근을 사용하여 이 마우스에서 양철 신경의 골수화한 축소에 있는 신경필라멘트 수송을 분석하기 위한 실험적인 접근을 기술합니다. 이러한 접근법의 첫 번째는 위에서 설명한 펄스 이스케이프 방법입니다. 이 방법은 신경필라멘트의 일시 중지 동작에 대한 정보를 생성할 수 있지만 필라멘트가 활성화된 영역을 출발하는 방향으로 눈이 멀어 순 방향성 및 수송 속도8의측정을 허용하지 않는다. 이러한 접근법의 두 번째는 활성화된 영역에서형광손실뿐만 아니라 형광필라멘트가 전방 및 역행 방향으로 활성화된 영역을 떠날 때 이동하는 두 개의 측면 창에서 형광의 일시적인 증가를 분석하는 새로운 펄스 확산 방법입니다. 두 가지 접근법 모두에서 평균 속도, 순 방향성 및 일시 중지 동작과 같은 신경 필라멘트 수송의 매개 변수는 측정 창에서 형광변화의 변화에 대한 수학적 분석 및 모델링을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 3은 이 두 가지 방법을 보여 줍니다.
이 프로토콜은 ImageJ9의FIJI 분포 패키지를 사용하여 획득 된 이미지에서 paGFP 형광의 신경 의 해부 및 제조, 활성화 및 이미징, 및 신경 필라멘트 수송의 정량화를 보여줍니다. 우리는 긴 (몇 cm)이며 분기하지 않기 때문에 경골 신경을 사용합니다. 그러나, 원칙적으로 paGFP-NFM을 표현하는 신경은 축축을 손상시키지 않고 해부되고 탈피될 수 있는 경우에 이 기술로 사용하기에 적합합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>1907-1422-100</td>
			<td>inner gasket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Round Gasket w/ Holes</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>1907-08-750</td>
			<td>outer gasket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10mm dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>153066</td>
			<td>dissection dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40mm round coverslips</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>40-1313-0319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL syringe - Luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Revolution WD spinning-disk confocal system</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>for fluorescein slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>fine tipped forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>47 50 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pan with wax</td>
			<td>Ginsberg Scientific</td>
			<td>568859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>initial dissection scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS2 perfusion chamber</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH27-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminectomy forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>initial dissection forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microaqueduct slide</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>130119-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td>for fluorescein slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage insert</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>I-3017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Oko Touch with objective collar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective oil - type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodoacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Sage Instruments</td>
			<td>Model 355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing adapter - female</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>1005109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing adapter - male</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>1005012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td></td>
			<td>1/16&#34; ID, 1/32&#34; wall thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve

Neurofilament 단백질 폴리머는 일평균 ~ 0.35-3.5 mmmm의 속도로 축산 수송의 느린 성분에서 축축을 따라 움직입니다. 최근까지 이 운동의 연구는 방사성 이소토피맥 라벨링을 사용하여 가능했으며, 이는 며칠간의 시간적 해상도와 밀리미터의 공간 해상도로 전체 신경에서 축산 수송을 분석할 수 있게 해주였습니다. 더 높은 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송을 연구하기 위해, 우리는 뉴런에서 광액표 GFP로 태그 신경 필라멘트 단백질 M을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질 성 마우스를 개발했습니다. 여기서우리는 이러한 마우스 ex vivo로부터의 한 골수염 축삭에서 신경필라멘트 수송을 분석하기 위해 형광활성화 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법을 설명한다. 고립 된 신경 세그먼트는 산소식염수와 관류에 의해 현미경 단계에서 유지되고 디스크 공초점 형광 현미경 을 회전하여 이미지화됩니다. 보라색 빛은 짧은 축축절 창에서 형광을 활성화하는 데 사용됩니다. 활성화 및 측면 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 분석되어 분 및 미크론 순서에 대한 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송 연구를 허용합니다. 수학 모델링은 결과 데이터에서 속도, 방향 편향 및 일시 중지 동작을 포함하여 neurofilament 전송의 운동 매개 변수를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법은 또한 그밖 신경에 있는 신경 필라멘트 수송을 시각화하기 위하여 적응될 수 있습니다. 추가 형질 전환 마우스의 발달로, 이 방법은 또한 착상에 있는 그밖 사이토스켈레탈 및 세포경 단백질의 축축한 수송을 심상 하고 분석하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

그림 3은 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 대표적인 이미지를 보여줍니다. ,우리는 펄스 탈출 방법과 그 데이터5,,6,,7,8,17의분석을위한 우리의 방법을 사용하여 얻은 데이터를 설명하는 여러 연구를 발표했다.8 아래에서 펄스 확산 데이터가 이전에...

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Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

이 프로토콜은 형광 현미경 검사를 사용하여 청소년 또는 성인 마우스에서 골수화 된 축절 에서 신경 필라멘트 인구의 직접 이미징을 허용하여 고립 된 신경 세그먼트에서 신경 필라멘트 수송의 방향성과 속도를 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 관심있는 단백질의 광액형 형광 융합을 표현하는 마우스의 가용성에 따라 다르지만 쉽게 해부된 신경에서 사용하기 위해 적응 할 수 있습니다. 시작하려면 산소식 식염수에 60 밀리리터 주사기에 붓고 주사기에 최소한의 공기가 남아 있는지 확인하십시오.주사기를 튜브에 연결한 다음 유출 튜브를 폐기물 플라스크에 넣습니다. 외부 개스킷을 관류 챔버 하우징에 넣고 유동 입구와 콘센트 기둥이 개스킷의 구멍과 정렬되도록 한 다음, 내부 개스킷을 1.5 원형 커버슬립에 놓고 개스킷의 주름을 조심스럽게 매끄럽게 하여 단단한 밀봉을 보장합니다. 커버슬립과 개스킷을 종이 타월에 놓거나 개스킷을 향하여 닦아냅니다.큰 해부 가위를 사용하여 척추 의 중간 근처 피부에 등색 절개를하고 동물의 복부 측면 주위에 절단계속합니다. 천천히 근육에서 피부를 당기고 근막을 잘라. 다음으로, 미세 절 부 가위를 사용하여 꼬리와 무릎 사이의 허벅지 근육에 절개를하여 좌골 신경을 노출시십시오.근육을 통해 볼 수있는 신경이 절단되지 않았는지 확인하십시오. 절개를 보조하고 통풍구로 확장하여 근육을 제거한 다음 종아리 근육을 제거하고 상처를 얕고 짧게 유지하여 신경을 손상시키지 않도록 합니다. 신경신경이 상골 신경에서 발 뒤꿈치로 분기되는 지점에서 완전히 드러낼 때까지 근육을 계속 제거하십시오.척추 근위쪽 끝에 있는 양철 신경을 한 쌍의 집게로 잡고 미세 절 가위로 잘라 신경에 너무 많은 긴장을 가하지 않도록 하십시오. 조심스럽게 근육에서 그것을 들어 올리고 신경에 긴장을 두지 않도록주의, 어떤 첨부 파일을 잘라. 경골 신경의 척추 불경한 끝을 잘라 실온 산소식식염수의 작은 페트리 접시로 옮기습니다.신경의 근위 쪽 끝에서 시작하여 노출된 축축을 매우 미세한 팁 집게로 부드럽게 잡습니다. 두 번째 포셉으로 신경 칼집을 근교로 잡고 천천히 신경의 말단쪽으로 당겨서 이 과정에서 과도한 긴장이 적용되지 않도록 합니다. 신경의 근근 끝을 잡고 천천히 덮개 슬립에 내려 놓고 부드러운 긴장하에서 곧게 펴습니다.홈 슬라이드를 사용하여 신경 위에 마이크로 커덕스 슬라이드를 놓고 신경에 평행하게 흐르는 흐름을 배치합니다. 커버슬립 및 마이크로커덕트 어셈블리를 뒤집어 서외부 개스킷에 반대하는 슬라이드로 관류 챔버 하우징에 놓습니다. 증혈 챔버를 고정하려면 금속 하우징에 놓고 잠금 링을 회전시하십시오.식염수 주사기 플런저를 천천히 누르고 관류 챔버를 채웁니다. 설치 및 이미징 중에 입구와 콘센트 튜브, 콘센트 플라스크 및 주사기를 항상 챔버 자체 위로 높이게 유지하십시오. 주입 어셈블리를 반전 된 현미경 단계로 옮기고 식염수 주사기를 주사기 펌프에 장착 한 다음 모터를 시작하고 분당 0.25 밀리리터의 유량 속도를 조정합니다.인라인 용액 히터를 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 객관적인 히터를 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 목표에 오일을 적용하고 단계 마운트에 주입 챔버를 삽입합니다.챔버 히터 패드에 오일을 적용하고 관류 챔버에 부착 한 다음 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 발판 챔버를 무대 어댑터에 잠그고 목표 오일을 챔버 밑면의 커버슬립과 접촉하십시오. 브라이트필드 조명을 사용하여 커버슬립 표면에 가장 가까운 신경의 하단 표면에 축축층의 층에 초점을 맞춥니다.골수화 축축은 대조 향상 없이 브라이트필드 전송 된 빛 조명 에서 볼 수 있는 myelin 칼집의 존재에 의해 식별 될 수있다. 브라이트필드 기준 영상을 획득하여 신경의 방향성을 기록한 다음, 488나노미터 레이저와 광액성 GFP에 적합한 방출 필터를 사용하여 공초점 이미지를 습득한다. 레이저 전력을 약 5배 의 정상 이미징 전력으로 설정하고 노출 시간이 3~4분 인 이미지를 획득한 다음 표백 단계 후 사전 활성화 자동 형광을 기록하기 위해 또 다른 공초점 이미지를 습득합니다.브라이트필드 이미지의 원하는 활성화 창 크기와 동일한 길이의 축축에 평행선을 그립니다. 이 선을 가이드로 사용하여 축축에 수직으로 뷰 필드에 걸쳐 관심 있는 직사각형 영역을 그립니다. 405 나노미터 빛으로 패턴 여기를 사용하여 이 지역의 GFP 형광을 활성화하여 활성화 직전에 바로 이미지를 획득하도록 합니다.활성화가 완료되면 1분 타이머를 시작합니다. 꺼지면 타임랩스 시리즈의 인수를 시작합니다. 250 밀리그램의 형광 분말을 이중 증류수 0.5 밀리리터에 넣고 눈에 보이는 입자가 없을 때까지 혼합한 다음 탁상 원심분리기에서 30초 동안 용액을 회전하여 용해되지 않은 물질을 퇴적시킵니다.슬라이드에 8마이크로리터의 형광액을 추가하고 1.5개의 커버슬립을 적용합니다. 여분의 액체를 블롯하고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 슬라이드가 건조할 수 있도록하십시오. 슬라이드 커버슬립 측을 반전 된 현미경 단계에 내려 놓고 커버 슬립의 표면에 형광의 얇은 평면에 초점을 조정합니다.슬라이드를 움직여 기포 또는 큰 형광 입자가 포함되지 않은 시야를 찾고 중간 이미지가 원래 초점 평면인 0.2 마이크로미터 간격으로 6마이크로미터 간격으로 6마이크로미터에 달하는 Z 스택을 획득합니다. 카메라 셔터를 포함한 모든 라이트 패스 셔터를 닫고 레이저 출력과 노출 시간을 0초로 설정합니다. 이러한 설정으로 100개의 이미지 스택을 획득하여 다크 필드 이미지를 생성하기 위해 평균값이 됩니다.펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 대표적인 이미지가 여기에 표시됩니다. 펄스 이스케이프 방법의 경우, 활성화된 영역에서형광 붕괴 역학은 장기 및 단기 일시 중지 동작에 대한 정보를 얻을 수 있다. 활성화된 영역은 이러한 실험에 대해 짧을 수 있습니다.더 긴 활성화 영역은 형광 신경 필라멘트의 더 큰 풀을 제공하기 위해 펄스 확산 방법에 사용됩니다. 이렇게 하면 측면 영역의 형광 증가가 선형으로 유지되는 시간이 길어집니다. 15 마이크로미터 측면 창은 여기에 사용됩니다.측정 창으로부터의 총 형광은 정량화되었다. 부패는 궤도 신경 필라멘트의 출발을 나타내는 초기 지수 붕괴와 오프 트랙 필라멘트의 출발을 나타내는 10 ~20 분에 두 번째 느린 기하급수적 인 부패와 펄스 탈출 방법에 대한 biphasic입니다. 펄스 확산 전략의 경우 이동속도와 방향성의 계산은 측면 창의 경사면에만 의존합니다.여기에 사용된 창 길이의 경우 선형 위상은 약 5분 동안 연장됩니다. 글리코리티억제신경으로부터의 타임랩스가 여기에 표시되어 활성화된 영역으로부터의 수송이 뚜렷하게 감소하는 것을 보여준다. 실제로, 말단과 근위 경사는 억제제로 취급된 신경에서 현저하게 낮습니다.또한이 두 조건 사이 인구 속도에서 상당한 감소가 있다. 이 프로토콜을 시도할 때, 동물의 희생에 따라 신경 건강이 감소함에 따라 해부 및 챔버 조립 부분을 수행하는 것이 시급하다는 것을 기억하십시오. 신경 세포 배양은 개별 신경 필라멘트의 운동의 측정 그리고 분석을 허용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...