Name: imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve at JoVE.com

Yazarlar öğretim ve konfokal mikroskopi ve tibial sinir diseksiyonu ve Dr Atsuko Uchida, Chloe Duger ve Sana Chahande fare yetiştiriciliği ile yardım için yardım için Paula Monsma teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen A.B.'ye ios1656784 osb'nin ortak Ulusal Bilim Vakfı Hibeleri tarafından desteklenmiştir. ve IOS1656765 P.J., ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 NS038526, P30 NS104177 ve S10 OD010383 A.B. N.P.B. Ohio State Üniversitesi Rektörü'nün Doktora Sonrası Akademisyenler Programı'ndan bir burs tarafından desteklendi.

Burada açıklanan tüm yöntemler Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Sinir saline çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>Breuer'in tuzlu10 10mL'sini yapın : 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, %5.6 D-glukoz, 23.8 mM NaHCO3 çift distile suda.</li>
	<li>Kabarcık 95% oksijen / 5% karbondioksit (carbogen) kullanmada...

<ol>
	<li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons.">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li><li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Axonal+Transport.">Slow Axonal Transport.</a> Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).</li><li>Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses.">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li><li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons.">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li><li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons.">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li><li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells.">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li><li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier.">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li><li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method.">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis.">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li><li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes.">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li><li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes.">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li><li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival.">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).</li><li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images.">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li><li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD(P)H+and+flavoprotein.">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li><li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics.">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li><li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses.">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li><li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons.">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li><li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve.">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).</li><li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+size+index:+d.">The effect size index: d.</a> Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo.">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li><li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+"P301L"+tau+knockin+mouse.">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li><li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li><li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability.">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li></ol>

Bakım-kaçış ve nabız yayılımı deneylerinin analizinde dikkatli olunmalıdır, çünkü özellikle düz alan düzeltmesi, görüntü hizalama ve çamaşır suyu düzeltmesi sırasında, işlem sonrası hatanın ortaya çıkması için önemli bir potansiyel vardır. Düz alan düzeltmesi, aydınlanmadaki tekdüzelik için düzeltmegereklidir, bu da merkezden çevreye görüş alanı boyunca yoğunlukta bir düşüşe neden olur. Tekdüzeliğin kapsamı dalga boyuna bağlıdır ve bu nedenle, her zaman deneysel ver...

Nörofilamentlerin aksonal nakli ilk kez 1970'lerde radyoizotopik nabız etiketleme1ile gösterilmiştir. Bu yaklaşım in vivonörofilament taşıma hakkında bilgi zenginliği vermiştir , ama nispeten düşük uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir, genellikle milimetre ve gün sırasına göre en iyi2. Ayrıca, radyoizotopik darbe etiketleme enjeksiyon ve tek bir zaman ders oluşturmak için birden fazla hayvan kurban gerektiren dolaylı bir yaklaşımdır. 1990'larda floresan proteinlerin keşfi ve floresan mikroskopi deki gelişmelerle, daha sonra nörofilament naklini doğrudan kültürlü nöronlarda saniye veya dakika lık bir zaman ölçeğinde ve mikrometre altı uzamsal çözünürlükte görüntülemek mümkün hale geldi ve hareketmekanizmasınaçok daha fazla fikir kazandırdı 3 . Bu çalışmalar, aksonların nörofilament polimerlerinin mikrotübül motor proteinleri tarafından itilen mikrotübül parçaları boyunca hem anterograd hem de retrograd yönlerde hızlı ve aralıklı olarak hareket ettiğini ortaya koymuştur. Ancak, nörofilamentler genellikle nanometre sadece onlarca tarafından komşularından ayrı aralıklı olan çapı sadece 10 nm kırınım sınırlı yapılardır; bu nedenle, polimerler sadece hareket eden polimerler komşularından çözülebilir böylece seyrek dağıtılmış nörofilamentler içeren kültürlü nöronlar izlenebilir4. Bu nedenle, miyelinatlı aksongibi bol nörofilament polimerler içeren aksonlarda tek nörofilamentleri takip etmek günümüzde mümkün değildir.
Floresan mikroskopisi kullanarak nörofilament açısından zengin aksonların nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için, kültürlü sinir hücrelerindeki nörofilamentlerin uzun süreli duraklama davranışını incelemek için geliştirdiğimiz floresan fotoaktivasyon darbe kaçış yöntemini kullanıyoruz4,5. Fotoaktibl floresan nörofilament füzyon proteini ile etiketlenen nörofilamentler akson kısa bir segmentte aktive edilir, ve daha sonra aktive bölgeden bu filamentlerin ayrılma oranı zaman içinde floresan çürüme ölçülerek ölçülür. Bu yaklaşımın avantajı, tek tek nörofilament polimerlerin hareketini izlemek için gerek kalmadan dakika veya saat bir zaman ölçeğinde uygulanabilir nörofilament taşıma bir nüfus düzeyinde analizi olmasıdır. Örneğin, miyelinating kültürlerde nörofilament transport kinetik analiz etmek için bu yöntemi kullandık6.
Son zamanlarda, insan nöron spesifik Thy1 organizatörü kontrolü altında nöronlarda bir paGFP etiketli nörofilament protein M (paGFP-NFM) düşük seviyelerde ifade bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare gelişimini anlattı7. Bu fare floresan mikroskopisi kullanarak yerinde nörofilament taşıma analizine izin verir. Bu makalede, bu farelerden gelen tibial sinirlerin miyelinli aksonları nörofilament naklini analiz etmek için deneysel yaklaşımları iki yaklaşım la açıklıyoruz. Bu yaklaşımlardan ilki yukarıda açıklanan darbe kaçış yöntemidir. Bu yöntem nörofilamentlerin duraklama davranışı hakkında bilgi üretebilir, ancak filamentlerin aktive edilen bölgeden ayrıldığı yöne kördür ve bu nedenle net yön ve taşıma hızının ölçülmesine izin vermez8. Bu yaklaşımların ikincisi, sadece aktive bölgeden gelen floresan kaybını değil, aynı zamanda floresan filamentlerin aktive edilen bölgeden hem anterograd hem de retrograd yönlerde hareket ettikleri iki yan penceredeki floresan geçici artışı da analiz ettiğimiz yeni bir nabız yayma yöntemidir. Her iki yaklaşımda da ortalama hız, net yönlülük ve duraklama davranışı gibi nörofilament taşıma parametreleri matematiksel analiz ve ölçüm pencerelerinde floresan değişikliklerin modelalınması ile elde edilebilir. Şekil 3 bu iki yaklaşımı göstermektedir.
Bu protokol, imageJ9'unFIJI dağıtım paketini kullanarak elde edilen görüntülerden sinirin diseksiyonunu ve hazırlanmasını, paGFP floresansının aktivasyonu ve görüntülenmesi ve nörofilament taşınmasının niceliğini göstermektedir. Kaval siniri uzun (birkaç cm) olduğu ve dallanmadığı için kullanıyoruz; ancak, ilke olarak paGFP-NFM ifade eden herhangi bir sinir aksonlar zarar vermeden diseksiyon ve de-sheathed olabilir eğer bu teknik ile kullanmak için uygundur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>1907-1422-100</td>
			<td>inner gasket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Round Gasket w/ Holes</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>1907-08-750</td>
			<td>outer gasket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10mm dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>153066</td>
			<td>dissection dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40mm round coverslips</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>40-1313-0319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL syringe - Luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Revolution WD spinning-disk confocal system</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>for fluorescein slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>fine tipped forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>47 50 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pan with wax</td>
			<td>Ginsberg Scientific</td>
			<td>568859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>initial dissection scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS2 perfusion chamber</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH27-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminectomy forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>initial dissection forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microaqueduct slide</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>130119-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td>for fluorescein slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage insert</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>I-3017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Oko Touch with objective collar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective oil - type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodoacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Sage Instruments</td>
			<td>Model 355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing adapter - female</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>1005109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing adapter - male</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>1005012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td></td>
			<td>1/16&#34; ID, 1/32&#34; wall thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve

Nörofilament protein polimerleri aksonal taşımanın yavaş bileşeninde aksonlar boyunca ~0.35-3.5 mm/gün ortalama hızlarda hareket eder. Yakın zamana kadar yerinde bu hareketin çalışma sadece radyoizotopik darbe etiketleme kullanarak mümkün oldu, hangi gün bir zamansal çözünürlük ve milimetre bir mekansal çözünürlük ile tüm sinirlerde aksonal taşıma analizi sağlar. Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile yerinde nörofilament taşıma çalışma için, nörofilament protein M nöroniklerde fotoaktivabl GFP ile etiketlenmiş ifade eden bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare geliştirdi. Burada floresan fotoaktivasyon darbe kaçış ve nabız-spread yöntemleri bu fareler ex vivotibial sinirlerin tek miyelinli akson nörofilament taşıma analiz etmek için açıklar. İzole sinir segmentleri oksijenli salin ile perfüzyon ile mikroskop aşamasında korunur ve dönen disk konfokal floresan mikroskop mikroskopile görüntülenir. Mor ışık kısa bir aksonal pencerede floresan etkinleştirmek için kullanılır. Aktive ve yan bölgelerdefloresan zaman içinde analiz edilir, dakika ve mikron sırasına göre zamansal ve mekansal çözünürlük ile nörofilament taşıma çalışma izin, sırasıyla. Matematiksel modelleme hız, yön önyargı ve ortaya çıkan verilerden duraklama davranışı da dahil olmak üzere nörofilament taşıma kinetik parametreleri ayıklamak için kullanılabilir. Nabız kaçış ve nabız yayma yöntemleri de diğer sinirlerde nörofilament taşıma görselleştirmek için adapte edilebilir. Ek transgenik farelerin geliştirilmesi ile, bu yöntemler de görüntü ve akson diğer sitoskelet ve sitosolik proteinlerin aksonal taşıma analiz etmek için kullanılabilir.

Şekil 3, darbe kaçışı ve darbe yayılımı deneylerinden temsili görüntüler gösterir. Biz darbe-kaçış yöntemi ve buverilerinanalizi için yöntemlerimiz5,6,,7,8,17kullanılarak elde edilen verileri açıklayan çeşitli çalışmalar yayınladık. Aşağıda, nabız yayılımı verilerinin daha önce bildirmediğimiz ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve at JoVE.com

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanarak genç veya yetişkin farelerden miyelinli aksonların nörofilament popülasyonunun doğrudan görüntülenmesine olanak sağlayarak izole sinir segmentlerinde nörofilament taşımanın yön ve hızını ölçmeyi mümkün kılar. Bu yöntem ilgi protein bir fotoaktiz floresan füzyon ifade farelerin durumu bağlıdır, ancak herhangi bir kolayca parçalanmış sinir kullanılmak üzere adapte edilebilir. Başlamak için, 60 mililitrelik şırınga içine oksijenli tuzlu dökün ve şırıngada minimum hava kaldığından emin olun.Şırıngayı boruya bağlayın ve çıkış tüpünü bir atık şişesine yerleştirin. Dış contayı perfüzyon odası gövdesine yerleştirin, akış giriş ve çıkış direklerinin contadaki deliklerle hizalanmasını sağlayın, sonra iç contayı 1,5 numaralı dairesel örtüye yerleştirin ve sıkı bir mühür sağlamak için contadaki kırışıklıkları dikkatlice düzeltin. Kapak ve contayı kağıt havluya veya conta yukarı bakacak şekilde bir görev mendili üzerine yerleştirin.Omurganın ortasına yakın deride bir dorsal kesi yapmak ve hayvanın ventral yönü etrafında kesmeye devam etmek için büyük diseksiyon makas bir çift kullanın. Yavaşça kas uzak deri çekin ve fasya kesti. Daha sonra, siyatik sinir ortaya çıkarmak için kuyruk ve diz arasında orta uyluk kasları bir kesi yapmak için mikrodiskes makas kullanın.Kas yoluyla görülebilir sinir, kesilmediğinden emin olun. Kas kaldırmak için kesi dorsally ve ventrally genişletin, sonra buzağı kasları kaldırmak, kesikler sığ ve kısa sinirlere zarar önlemek için tutmak. Tibial sinir tamamen topuk siyatik sinir dalları noktadan maruz kalana kadar kasları kaldırmaya devam edin.Forceps bir çift ile omurga proksimal ucunda tibial sinir kavramak ve mikrodizeksiyon makas bir çift ile kesilmiş, sinir için çok fazla gerginlik uygulamak değil emin olun. Dikkatle kas uzak kaldırın ve herhangi bir ekleri kesti, sinir üzerinde gerginlik koymak için dikkat. Tibial sinirin omurga distal ucunu kesin ve oda sıcaklığında oksijenli tuzlu küçük bir Petri kabına aktarın.Sinirproksimal ucundan başlayarak, yavaşça çok ince uç forceps bir çift ile maruz akson biter kavramak. Forceps ikinci bir çift ile, proksimally sinir kılıfı kavramak ve yavaş yavaş bu işlem sırasında hiçbir gereksiz gerginlik uygulandığından emin olmak için sinirdistal sonuna doğru çekin. Sinirproksimal ucunu kavrayın ve yavaşça bir kapak üzerine yatırın, sonra hafif gerginlik altında düzleştirmek.Mikroakemer kaydırakları, oluklu kaydırakla sinirin üzerine yerleştirin ve akış yönünü sinire paralel konumlandırın. Kapak ve mikroakemer tertibatını ters çevirin ve dış contaya karşı olan kaydırakla perfüzyon odası gövdesine yerleştirin. Profüzyon odasını sabitlemek için, metal gövdeye yerleştirin ve kilitleme halkasını döndürün.Yavaşça tuzlu şırınga piston depress ve perfüzyon odası doldurun. Kurulum ve görüntüleme sırasında giriş ve çıkış borusu, çıkış şişesi ve şırıngayı her zaman odanın üzerinde tutun. Profüzyon tertibatını ters bir mikroskop aşamasına aktarın ve tuzlu şırıngayı şırınga pompasına monte edin, ardından motoru çalıştırın ve hızı dakikada 0,25 mililitre akış hızına ayarlayın.Sıralı çözelti ısıtıcıbağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Objektif ısıtıcıbağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Hedefe yağ uygulayın ve profüzyon odasını sahne montajına takın.Oda ısıtıcı ped yağ uygulayın ve perfüzyon odasına takın, sonra bağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Profüzyon odasını sahne adaptörüne kilitleyin ve nesnel yağı odanın alt tarafındaki kapak kaymasıyla temas edin. Kapak yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanmak için Brightfield aydınlatmasını kullanın.Miyelinli aksonlar, Brightfield iletilmiş ışık aydınlatması altında kontrast geliştirme olmadan görülebilen bir miyelin kılıfının varlığı ile tanımlanabilir. Bir Brightfield referans görüntü elde, sinir in yön kaydı, sonra bir 488 nanometre lazer ve fotoaktibl GFP için uygun bir emisyon filtresi kullanarak bir konfokal görüntü elde. Lazer gücünü yaklaşık beş kat normal görüntüleme gücüne ayarlayın ve pozlama süresi üç ila dört dakika olan bir görüntü elde edin, ardından beyazlatma adımından sonra aktivasyon öncesi otofloresansı kaydetmek için başka bir konfokal görüntü edinin.Brightfield görüntüsünün istenen etkinleştirme penceresi boyutuna eşit uzunlukta aksonlarla paralel bir çizgi çizin. Bu satırı kılavuz olarak kullanarak, aksonları dik görüş alanına dikdörtgen bir ilgi alanı çizin. 405 nanometre ışıkla desen uyarma ile bu bölgedeki GFP floresansını etkinleştirin ve etkinleştirmeden hemen önce ve hemen ardından bir görüntü elde edilir.Etkinleştirme sona ererken, bir dakikalık zamanlayıcı başlatın. Patladığında, bir timelapse serisi nin edinimi başlar. 0,5 mililitre çift distile suya 250 miligram floresan tozu ekleyin ve görünür parçacıklar olmayana kadar karıştırın, ardından çözünmemiş herhangi bir malzemeyi tortulamak için bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca çözeltiyi döndürün.Bir slayta sekiz mikrolitre floresan çözeltisi ekleyin ve 1,5 kapak lı bir sayı uygulayın. Fazla sıvıyı blotlayın, kapağı ojeyle kapatın ve kaydırağın kurumasını bekleyin. Slayt kapağı tarafını ters mikroskop aşamasına yerleştirin ve odağı kapak kayması yüzeyindeki ince floresan düzlemine ayarlayın.Hava kabarcıkları veya büyük floresan parçacıkları içermeyen bir görüş alanı bulmak için kaydırağı hareket ettirin ve orta daki görüntünün orijinal odak düzlemi olması için 0,2 mikrometre aralıklarla altı mikrometreye yayılan bir Z-yığını edinin. Kamera deklanşörü de dahil olmak üzere tüm ışık yolu panjurlarını kapatın ve lazer gücünü ve pozlama süresini sıfır saniyeye ayarlayın. Karanlık alan görüntüsünü oluşturmak için ortalama olacak bu ayarlarla 100 görüntü yığını edinin.Darbe kaçış ve nabız yayılımı deneylerinden elde edilen temsili görüntüler burada gösterilmiştir. Darbe kaçış yöntemi için, aktive bölgede floresan çürüme kinetik uzun vadeli ve kısa vadeli duraklama davranışı hakkında bilgi verebilir. Etkinleştirilen bölge bu deneyler için kısa olabilir.Floresan nörofilamentler daha büyük bir havuz sağlamak için daha uzun aktif bölge nabız yayma yöntemi için kullanılır. Bu, kanat bölgelerindeki floresan artışının doğrusal olarak kaldığı süreyi uzatır. Burada 15 mikrometre yan pencere kullanılmaktadır.Ölçüm penceresinden gelen toplam floresan ölçüldü. Çürüme, on-track nörofilamentlerin gidişini temsil eden ilk üstel bozunma ve 10 ila 20 dakika arasında ikinci bir yavaş üstel çürümeyi temsil eden, pist dışı filamentlerin gidişini temsil eden darbe kaçış yöntemi için bifhasiktir. Darbe yayılımı stratejisi için, hareketin hız ve yönlülüğünün hesaplamaları sadece yan camların eğimlerine bağlıdır.Burada kullanılan pencere uzunlukları için doğrusal faz yaklaşık beş dakika uzar. Glikoletik olarak inhibe edilmiş bir sinirin timelapse burada gösterilmiştir, aktive bölgenin dışına taşıma belirgin bir azalma gösteren. Gerçekten de, distal ve proksimal eğimler inhibitör ile tedavi sinirlerde önemli ölçüde daha düşüktür.Ayrıca bu iki durum arasında nüfus hızında önemli bir azalma vardır. Bu protokolü denerken, hayvanın kurban edilmesinden sonra sinir sağlığı nın düşmesi nedeniyle diseksiyonu ve oda montaj bölümlerini yaparken aceleci davranmanın çok önemli olduğunu unutmayın. Nöronal hücre kültürü, bu protokol kullanılarak toplanan nüfus ölçeği verilerini tamamlayacak olan bireysel nörofilamentlerin hareketinin ölçülmesine ve analizine izin verebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nörobilim

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Vivo Multimodal görüntüleme ve fare lazer kaynaklı Choroidal neovaskülarizasyon Model analizi

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...