Este protocolo permite la caracterización y el uso de microcobales para la resonancia magnética de campo ultra alto. La RMN es una herramienta única y no invasiva para explorar las propiedades de fisiología, metabolismo y difusión de la muestra biológica. Utilizando alta resistencia de campo magnético y microcobinas adaptadas a una muestra de interés, se pueden obtener imágenes de hasta resolución celular.
En este método, describimos paso a paso cómo determinar las características de las microcobalas comerciales o caseras para aplicaciones de imágenes. Utilizamos especímenes biológicos de menos de un milímetro de diámetro y un espectrómetro de RMN de diámetro vertical de campo ultra alto. Usando microcobales caseros, podemos ajustar el tamaño de la bobina de radiofrecuencia al tamaño de la muestra.
En esta investigación, estamos usando un pequeño pedazo de raíz vegetal. Esto es útil porque la sensibilidad de la bobina es proporcional al diámetro de la bobina decreciente. Por lo tanto, podemos obtener imágenes con una mayor relación señal-ruido para muestras pequeñas.
Debido al pequeño tamaño y la naturaleza frágil de estas microcobalanzas, es importante establecer algunos parámetros básicos como, por ejemplo, la longitud de pulso de 90 grados y la potencia de pulso, los límites de funcionamiento seguros, y finalmente calcular la sensibilidad de la bobina de una manera que se puede comparar a través de diferentes sistemas de RMN. La microcobra solenoide consiste en un cable enrollado alrededor de un capilar y dos capacitores: la afinación y el condensador coincidente. El condensador de ajuste se elige para lograr la frecuencia resonante deseada de 950 megahercios, mientras que el condensador coincidente ha elegido para lograr la máxima transmisión de señal.
Es una impedancia de 50 ohmios. El condensador más grande es variable para permitir un ajuste más fino. La bobina se encuentra sobre una placa base que se fija a un zócalo modificado.
Opcionalmente, se puede añadir un depósito para el fluido de coincidencia de susceptibilidad para reducir los efectos de susceptibilidad del cable de la bobina. En una transferencia de vidrio de reloj un mililitro de perfluorodecalin, o PFD, que se utilizará para sumergir la muestra. La PFD se utiliza ya que puede llenar espacios de aire en la muestra sin entrar en células biológicas.
Tampoco es observable por la RMN de protones. Cubra inmediatamente el PFD con una tapa de la placa Petri para evitar la evaporación antes de que sea necesario. Si prepara una muestra de referencia, utilice una solución de sulfato de cobre en su lugar.
A continuación, extraiga cuidadosamente un sistema radicular de su sustrato de crecimiento. Incluye una pequeña sección con bisturí. Para el tratamiento al vacío, coloque la muestra en un tubo Eppendorf que contenga una solución fijativa.
A continuación, selle el tubo con un filamento y perforar agujeros para permitir la ventilación. Somete la muestra al tratamiento al vacío. Se pueden observar burbujas de aire escapando de la muestra.
Mientras mira a través de un microscopio estéreo, utilice pinzas para sumergir tanto la muestra como el capilar en la solución preparada previamente. A continuación, inserte la muestra en el capilar con pinzas mientras tanto capilar como muestrea un totalmente sumergido. Utilice un capilar más pequeño o una punta de aguja de jeringa como varilla de empuje.
Forma el papel tisú en un punto fino y úsalo para eliminar alrededor de un milímetro de líquido de ambos extremos del capilar. Derretir, un pequeño volumen de cera capilar usando una pluma de cera. Aplique cera en ambos lados.
La cera se volverá opaca cuando se solidifique. Tenga cuidado de excluir las burbujas de aire del capilar. Después, raspa el exceso de cera usando un bisturí.
Inserte la muestra en la microcobra con pinzas, manteniendo la microbobina estable. Utilice una varilla para centrar la muestra en la bobina. Si la bobina se prueba por primera vez, utilice una muestra de referencia de sulfato de cobre para la calibración de potencia y determinar la homogeneidad del campo SNR y B1.
Este protocolo se demuestra en un espectrómetro Tesla de 22,3 diámetro vertical equipado con una sonda de micro imágenes con bobinas de gradiente integradas, capaz de hasta tres Tesla por metro. Fije la microcobina a la base de la sonda manteniendo la microbobina en posición vertical. A continuación, deslice sobre la bobina de gradiente de tres ejes.
Gire la rosca de tornillo en la base de la sonda para fijar el gradiente en su lugar. Inserte la sonda en el imán y realice las conexiones necesarias. Inicie una curva de tambaleo y ajuste la afinación y la coincidencia según sea necesario.
Se recomienda comenzar con un ancho de barrido espectral alto. Tenga en cuenta que pueden estar presentes varios modos resonantes. Las pruebas SNR para cada modo pueden ser necesarias para determinar el modo resonante correcto.
Seleccione la configuración de bobina correcta para su microbobina. En caso de que se desconozcan los límites seguros para las bobinas, comience con 10 microsegundos con una potencia de pulso baja de 0,6 vatios y aumente lentamente la longitud del pulso en un microsegundo a la vez hasta que aparezca una señal. Registre una curva de nutation para una nueva bobina para obtener la longitud de pulso y la potencia correctas para el pulso de 90 grados.
Para ello, varíe la duración del pulso sistemáticamente mientras mantiene constante la potencia del pulso. En el caso de un campo B1 inhomogéneo, el pulso de 90 grados se puede estimar a partir de las longitudes a las que se obtiene la intensidad máxima de la señal. Utilice una escala localizadora con un gran campo de visión para localizar la posición de la bobina dentro del imán.
Si la muestra está exactamente en el centro del sistema de degradado, el análisis del localizador mostrará la muestra. Si la bobina o la muestra están descentoras, ajuste el escaneo del localizador. Una vez que se encuentra una potencia de pulso aproximada utilizando la curva de nutación, variar las potencias de pulso gradualmente para una serie de imágenes para comprobar la imagen más homogénea.
Para algunas bobinas con un campo B1 inhomogénico, el pulso determinado de 90 grados puede ser sobreestimado lo que conduce a sobrepasar en el punto dulce deseado de la bobina. Ajuste manualmente el campo magnético basado en la señal FID. Dependiendo de la orientación de las cuñas de microcobales con diferente orientación puede resultar en una corrección más fuerte de la homogeneidad B0.
A continuación, se debe calcular un SNR normalizado por volumen. En primer lugar, calcule el volumen de vóxel multiplicando la resolución X e Y multiplicando el grosor del corte. El SNR se calcula restando el ruido medio de la señal media y dividiéndolo por la desviación estándar del ruido multiplicado por el volumen de voxel.
La señal media se toma del centro de la imagen, mientras que la señal de ruido se calcula a partir de los parches de esquina. Ejecute una secuencia de eco de degradado múltiple para comprobar si hay posibles problemas de susceptibilidad debido al cable de la bobina y a la propia muestra. Para las bobinas sumergidas, la diferencia en la susceptibilidad entre los cables de bobina y su entorno se reduce en gran medida.
Imágenes de alta resolución tal vez alcanzadas con experimentos flash 3D. Se pueden distinguir varias características de raíz, como la endodermis, la corteza y el xilem, que son difíciles de resolver utilizando bobinas más grandes. Las secuencias multislice y multiecho también se pueden utilizar para reducir la influencia de la susceptibilidad.
Sin embargo, esto viene a costa de una sensibilidad reducida por unidad de tiempo. Los nódulos radiculares de Medicago truncatula también pueden ser imageados usando este protocolo. Se obtuvo una resolución isotrópica de 31 micrómetros en cuatro minutos, mientras que se obtuvo una resolución isotrópica de 16 micrómetros en 33 minutos.
Esto permite estudiar en detalle varios aspectos fisiológicos de pequeños nódulos radiculares. Para una preparación exitosa de la muestra, es importante sumergir completamente tanto la muestra como el capilar en el líquido. Esto evita la formación de burbujas de aire que afectan negativamente a la calidad de la imagen.
Debido a que las imágenes por RMN no son destructivas, podemos extraer la muestra biológica después de la exploración por RMN y usarla para un estudio adicional utilizando, por ejemplo, la microscopía óptica. Después de ver este video, debe tener una comprensión básica de la caracterización y el funcionamiento de microcobos para aplicaciones de imágenes. Esto se puede aplicar a una amplia variedad de muestras biológicas.
