Detta protokoll möjliggör karakterisering och användning av mikroskylor för ultra hög fält magnetisk resonanstomografi. MRI är ett unikt och noninvasive verktyg för att utforska fysiologi, metabolism, och diffusion egenskaper biologiska exemplar. Med hjälp av hög magnetisk fältstyrka och mikroskopor anpassade till ett urval av intresse kan bilder av upp till cellulär upplösning erhållas.
I den här metoden beskriver vi steg-för-steg hur man bestämmer egenskaperna hos kommersiella eller hembyggda mikroskopiler för bildframställningsapplikationer. Vi använder biologiska exemplar mindre än en millimeter i diameter och en ultra hög fält vertikal bore NMR spektrometer. Med hjälp av hembyggda mikroskop, kan vi justera storleken på radiofrekvensspolen till storleken på provet.
I den här forskningen använder vi en liten bit växtrot. Detta är användbart eftersom spolen känslighet är proportionell mot den minskande spolen diameter. Vi kan därför få bilder med en högre signal till brusförhållande för små prover.
På grund av den ringa storleken och den ömtåliga karaktären hos dessa mikrospoler är det viktigt att fastställa några grundläggande parametrar som till exempel, 90 graders pulslängd och pulseffekt, de säkra driftgränserna och slutligen för att beräkna spolkänsligheten på ett sätt som kan jämföras mellan olika NMR-system. Solenoidmikropolen består av en tråd som är hopspolad runt en kapillär och två kondensatorer:trimningen och den matchande kondensatorn. Trimkondensatorn väljs för att uppnå önskad resonansfrekvens på 950 megahertz, medan den matchande kondensatorn har valt att uppnå den maximala signalöverföringen.
Det är en impedans på 50 Ohm. Den större kondensatorn är variabel för att möjliggöra finare justering. Spolen sitter på en bottenplatta som är fast på ett modifierat uttag.
Eventuellt kan en reservoar för känslighetsmatchningsvätska tillsättas för att minska känslighetseffekter från spoltråden. Till en urglasöverföring en milliliter perfluordekalin, eller PFD, som kommer att användas för att dränka provet. PFD används eftersom det kan fylla luftutrymmen i exemplaret utan att komma in i biologiska celler.
Det är inte heller observerbara av proton MRI. Täck omedelbart PFD med ett petriskålslock för att förhindra avdunstning innan den behövs. Om du förbereder ett referensprov använda en kopparsulfat lösning istället.
Därefter extraherar du noggrant ett rotsystem från sitt tillväxtsubstrat. Punktskatt ett litet avsnitt med hjälp av en skalpell. För vakuumbehandling, placera provet i ett Eppendorf-rör som innehåller en fixativ lösning.
Sedan försegla röret med en glödtråd och hål punch för att möjliggöra ventilation. Underställ provet vakuumbehandling. Luftbubblor kan ses fly provet.
Medan du tittar genom ett stereomikroskop använd pincett för att dränka både prov och kapillär i lösningen beredd tidigare. Sätt sedan in provet i kapillären med hjälp av pincett medan både kapillär och provsmaka en helt nedsänkt. Använd en mindre kapillär eller en spruta nål spets som en trycka spö.
Forma mjukpapper till en fin punkt och använd det för att ta bort runt en millimeter vätska från båda ändarna av kapillären. Smält, en liten volym kapillärvax med hjälp av en vaxpenna. Applicera vax på båda sidor.
Vaxet kommer att bli ogenomskinligt när det stelnar. Var noga med att utesluta luftbubblor från kapillären. Efteråt, skrapa bort överflödigt vax med hjälp av en skalpell.
Sätt in provet i mikrospolen med hjälp av pincett, samtidigt som mikrospolen håller stadigt. Använd en stång för att centrera provet i spolen. Om spolen testas för första gången, använd ett kopparsulfatreferensprov för effektkalibrering och bestämma SNR och B1-fältets homogenitet.
Detta protokoll demonstreras på en vertikal bore 22.3 Tesla-spektrometer utrustad med en mikrobildsprojs med integrerade gradientspolar, som kan upp till tre Tesla per meter. Fäst mikrospolen på probbasen samtidigt som mikrospolen förvaras upprätt. Sedan glida över trippel axel toningsspolen.
Vrid skruvgängan på probbasen för att fixera övertoningen på plats. Sätt in sonden i magneten och gör nödvändiga anslutningar. Initiera en wobblekurva och justera justering och matchning vid behov.
Från och med en hög spektral svepbredd rekommenderas. Var medveten om att flera resonanslägen kan finnas. SNR-tester för varje läge kan behövas för att fastställa rätt resonantläge.
Välj rätt spolekonfiguration för din mikrospole. I fall de säkra gränserna för spolarna är okända, börja med 10 mikrosekonden vid en låg pulseffekt på 0,6 watt och långsamt öka pulslängden med en mikrosekund i taget tills en signal visas. Spela in en mutteriseringskurva för en ny spole för att erhålla rätt pulslängd och effekt för 90 graders puls.
För att göra det variera pulsen varaktighet systematiskt samtidigt som pulsen makt konstant. Vid ett inhomogent B1-fält kan 90 graderspulsen uppskattas från de längder vid vilka maximal signalintensitet erhålls. Använd en lokalisatorskala med stort synfält för att lokalisera spolens position inom magneten.
Om provet är exakt i mitten av gradientsystemet kommer localizer-skanningen att visa provet. Om spolen eller provet är off-center, justera localizer scan. När en ungefärlig pulseffekt hittas med hjälp av mutterkurvan, variera pulskrafterna gradvis för en serie bilder för att kontrollera den mest homogena bilden.
För vissa spolar med en inhomogen B1 fält, den bestämda 90 graders puls kan överskattas leder till overtipping i önskad sweet spot av spolen. Shimsa manuellt magnetfältet baserat på FID-signalen. Beroende på inriktningen av mikrospolerna shims med olika orientering kan resultera i en starkare korrigering av B0 homogenitet.
Därefter måste en volym normaliserad SNR beräknas. Först beräkna voxel-volymen genom att multiplicera upplösningen X och Y gånger segmenttjockleken. SNR beräknas genom att subtrahera medelvärdet från medelvärdet signal och dividera den med standardavvikelsen för bruset multiplicerat med voxel-volymen.
Medelvärdet signal tas från mitten av bilden, medan brussignalen beräknas från hörnet patchar. Kör en multipel toningsekosekvens för att kontrollera om det finns potentiella känslighetsproblem på grund av spoltråden och själva provet. För nedsänkta spolar minskar skillnaden i mottaglighet mellan spoltrådarna och deras omgivning kraftigt.
Högupplöst bildbehandling kanske uppnås med 3D-flash experiment. Flera rotfunktioner kan särskiljas såsom endodermis, cortex och xylem, som är svåra att lösa med hjälp av större spolar. Multislice, multiecho sekvenser kan också användas för att minska påverkan av mottaglighet.
Detta kommer dock till kostnaden för minskad känslighet per tidsenhet. Rotknutor av Medicago truncatula kan också avbildas med hjälp av detta protokoll. En isotropisk upplösning på 31 mikrometer erhölls på fyra minuter, medan en isotropisk upplösning på 16 mikrometer erhölls på 33 minuter.
Detta gör att olika fysiologiska aspekter av små rot knölar som skall studeras i detalj. För framgångsrik provberedning är det viktigt att helt dränka både prov och kapillär i vätskan. Detta förhindrar bildandet av luftbubblor som negativt påverkar bildkvaliteten.
Eftersom MR imaging är icke-förstörande, kan vi ta bort den biologiska exemplaret efter MR scan och använda den för vidare studier med hjälp av till exempel optisk mikroskopi. Efter att ha sett den här videon bör du ha en grundläggande förståelse för mikrospole karakterisering och drift för bildbehandling applikationer. Detta får tillämpas på en mängd olika biologiska exemplar.