Name: dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization at JoVE.com

نود أن نشكر كلود ديسبلان لمشاركتنا حصصا من الجسم المضاد Bsh. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة DE-Cadherin و Dachshund و Eyes Absent و Seven-up و Bruchpilot من بنك الدراسات التنموية Hybridoma Bank ، الذي أنشأه NICHD التابع للمعاهد الوطنية للصحة وتم الحفاظ عليه في جامعة أيوا ، قسم علم الأحياء ، مدينة أيوا ، IA 52242. تم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف NSERC الممنوحة ل T.E. يتم دعم U.A. من خلال منحة NSERC Alexander Graham Bell Canada للخريجين. يتم دعم PV من خلال منحة أونتاريو للدراسات العليا.

1. تحضير أدمغة اليرقات للتصوير متحد البؤر
<ol><li>تشريح ملاحظة: قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد محاليل الإصلاح (4٪ فورمالديهايد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) و PBT (0.1-0.3٪ Triton في PBS). يجب وضع محلول الإصلاح على الجليد أثناء التشريح. على الرغم من استخدام مثبت بارافورمالدهايد (PFA) في هذا ...

<ol>
	<li>Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure.">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell Tissue Research. 258, (1989).</li><li>Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+and+early+differentiation+of+the+optic+lobes+in+Drosophila+melanogaster.">Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).</li><li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Insect+and+Vertebrate+Visual+Systems.">Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems.</a> Neuron. 66, 15-36 (2010).</li><li>N&#233;riec, N., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Eye+to+the+Brain.+Development+of+the+Drosophila+Visual+System.">From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 247-271 (2016).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Challenge+of+Numbers+and+Diversity:+Neurogenesis+in+the+Drosophila+Optic+Lobe.">A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe.</a> Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).</li><li>Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+the+generation+of+neuronal+diversity:+Lessons+from+the+fly+visual+system.">Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140 (2019).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Role+of+the+Vsx+Genes+Supports+a+Monophyletic+Origin+for+Bilaterian+Visual+Systems.">Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems.</a> Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+evolution+at+high+resolution:+The+neuron+as+a+unit+of+homology.">Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology.</a> Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+projection+neurons+in+the+Drosophila+lobula+link+feature+detection+to+distinct+behavioral+programs.">Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+pattern+of+neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+visual+system:+A+user's+guide+to+the+dynamic+morphology+of+the+developing+optic+lobe.">Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe.</a> Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+Drosophila+medulla+neuroblasts+controls+neural+fates.">Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates.</a> Nature. 498, 456-462 (2013).</li><li>Erclik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+temporal+and+spatial+patterning+generates+neural+diversity.">Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity.</a> Nature. 541, 365-370 (2017).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+region-specific+neurogenesis+mode+requires+migratory+progenitors+in+the+Drosophila+visual+system.">A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system.</a> Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).</li><li>Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+mechanism+that+produces+neuronal+diversity+in+the+Drosophila+visual+center.">A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center.</a> Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).</li><li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe.">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li><li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless/Pax6.">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li><li>Millard, S. S., Pecot, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+assembling+columns+and+layers+in+the+Drosophila+visual+system.">Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system.</a> Neural Development. 13, 1-17 (2018).</li><li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe:+The+input+terminals+to+the+medulla.">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li><li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation.">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li><li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+drosophila+melanogaster.">Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51792 (2014).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, 4139-4147 (1996).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval,+pupal+and+adult+Drosophila+retinas.">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> Journal of visualized experiments. , e4347 (2012).</li><li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains.">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174 (2017).</li><li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936 (2010).</li><li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper.">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li><li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit.">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li><li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts.">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756 (2014).</li><li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers.">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410 (2017).</li><li>&#214;zel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لمناعة اليرقات وأدمغة ذبابة الفاكهة البالغة وتركيبها في عدة اتجاهات. في حين أن طرق تلطيخ أدمغة اليرقات والبالغين قد تم وصفها سابقا22،23،24،27،28 ، فإن استراتيجيات التر?...

كان النظام البصري لذبابة الفاكهة ، الذي يتألف من العين المركبة والفص البصري الأساسي ، نموذجا ممتازا لدراسة تطور الدائرة العصبية ووظيفتها. في السنوات الأخيرة ، ظهر الفص البصري على وجه الخصوص كنظام قوي لدراسة عمليات النمو العصبي مثل تكوين الخلايا العصبية وأسلاك الدوائر1،2،3،4،5،6،7،8. وهي مكونة من أربعة الخلايا العصبية: الصفيحة ، النخاع ، الفصيص والصفيحة الفصيصة (الأخيران يشكلان مجمع الفصيصات)1،2،3،4،5،6. المستقبلات الضوئية من العين ، تستهدف الخلايا العصبية للصفيحة والنخاع ، والتي تعالج المدخلات البصرية وتنقلها إلى الخلايا العصبية لمجمع الفصيص1،2،3،4،5،6. ترسل الخلايا العصبية الإسقاطية في مجمع الفصيصات بعد ذلك معلومات مرئية إلى مراكز المعالجة العليا في الدماغالمركزي 1،5،9. إن التنظيم المعقد للفص البصري ، الذي تستلزمه الحاجة إلى الحفاظ على الشبكية ومعالجة أنواع مختلفة من المحفزات البصرية ، يجعله نظاما جذابا لدراسة كيفية تجميع الدوائر العصبية المتطورة. والجدير بالذكر أن النخاع يشترك في أوجه تشابه مذهلة في كل من تنظيمه وتطوره مع شبكية العين العصبية ، والتي كانت منذ فترة طويلة نموذجا لتطوير الدائرة العصبية الفقارية 3,8.
يبدأ تطور الفص البصري أثناء التطور الجنيني ، مع مواصفات ~ 35 خلية من خلايا الأديم الظاهر التي تشكل الشفرة البصرية2،4،5،6،7،8. بعد فقس اليرقات ، ينقسم البشارة البصرية إلى بدائيين متميزين: 1) مركز الانتشار الخارجي (OPC) ، الذي يولد الخلايا العصبية للصفيحة والنخاع الخارجي و 2) مركز الانتشار الداخلي (IPC) ، الذي يولد الخلايا العصبية للنخاع الداخلي ومجمع الفصيصات4،5،6،10. في أواخر اليرقة الثانية ، تبدأ الخلايا الظهارية العصبية في OPC و IPC في التحول إلى خلايا عصبية تولد لاحقا خلايا عصبية عبر الخلايا الأم العقدة الوسيطة4،5،11،12. يتم تصميم الخلايا العصبية للفص البصري من خلال عوامل النسخ المقيدة مكانيا وزمانيا ، والتي تعمل معا لتوليد التنوع العصبي في ذريتها11،12،13،14. في الخادرة ، يتم تجميع دوائر الخلايا العصبية للفص البصري من خلال تنسيق العديد من العمليات ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج11,15 ، والهجرة العصبية12,16 ، والاستهداف المحوري / التغصني 10,17 ، وتشكيل المشبك 18,19 ودورات الأعصاب10,17.
هنا ، نصف المنهجية التي يتم من خلالها تشريح أدمغة اليرقات والبالغين ، وتلطيخها بالمناعة وتركيبها لتصوير الفص البصري. نظرا لتنظيمه المعقد ثلاثي الأبعاد ، يتطلب تحليل الفص البصري أن يفهم المرء كيف يتم وضع الخلايا العصبية البالغة وأسلاف اليرقات بالنسبة لبعضها البعض والدماغ المركزي. وبالتالي ، فإننا نركز بشكل خاص على كيفية ارتباط اتجاه التركيب بالتنظيم المكاني لهياكل الفص البصري. وصفنا ثلاث استراتيجيات تركيب لأدمغة اليرقات (الأمامية والخلفية والجانبية) وثلاث لأدمغة البالغين (الأمامية والخلفية والأفقية) ، كل منها يوفر زاوية مثالية لتصوير مجموعة محددة من أسلاف الفص البصري أو neuropil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1077px;" width="1077">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">10x PBS</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">PBS405</td>
			<td style="width:357px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">37% formaldehyde</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">FOR201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 488 (goat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11055</td>
			<td>use at 1:501</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 555 (mouse) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-31570</td>
			<td>use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21450</td>
			<td>use at 1:503</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (rat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21247</td>
			<td>use at 1:502</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Cover slips</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #5</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #55</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissection Dish</td>
			<td style="width:325px;">Corning</td>
			<td>722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dry wipes</td>
			<td style="width:325px;">Kimbery Clark</td>
			<td style="width:164px;">34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Goat anti-Bgal primary antibody</td>
			<td>Biogenesis</td>
			<td></td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Bsh primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Gift from Claude Desplan</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Erclik et al. 2008</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:325px;">Parfilm</td>
			<td style="width:164px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:325px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:164px;">72.706.600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">CA4823-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-dac primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:164px;">mabdac2-3</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-eya primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">eya10H6</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-nc82 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">nc82</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-svp primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">Seven-up 2D3</td>
			<td>use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Polymer Clay</td>
			<td>Any type of clay can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11122</td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rat anti-DE-Cadherin primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">DCAD2</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Slowfade mounting medium</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">S36967</td>
			<td>Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization

يتكون الفص البصري من ذبابة الفاكهة ، الذي يتكون من أربعة خلايا عصبية: الصفيحة ، النخاع ، الفصيص والصفيحة الفصيصة ، هو نظام نموذجي ممتاز لاستكشاف الآليات التنموية التي تولد التنوع العصبي وتدفع تجميع الدائرة. نظرا لتنظيمه المعقد ثلاثي الأبعاد ، يتطلب تحليل الفص البصري أن يفهم المرء كيف يتم وضع الخلايا العصبية البالغة وأسلاف اليرقات بالنسبة لبعضها البعض والدماغ المركزي. هنا ، نصف بروتوكولا لتشريح وتلوين المناعة وتركيب أدمغة اليرقات والبالغين لتصوير الفص البصري. يتم التركيز بشكل خاص على العلاقة بين اتجاه التركيب والتنظيم المكاني للفص البصري. نصف ثلاث استراتيجيات تركيب في اليرقة (الأمامية والخلفية والجانبية) وثلاثة في البالغين (الأمامي والخلفي والأفقي) ، كل منها يوفر زاوية تصوير مثالية لهيكل الفص البصري المتميز.

يتم عرض الصور متحدة البؤر لليرقات والفصوص البصرية البالغة المثبتة في الاتجاهات الموصوفة في البروتوكول في الشكل 1 والشكل 2.
يوضح الشكل 1 مخططات وشرائح متحدة البؤر تمثيلية لأدمغة اليرقات الموضوعة في الاتجاهات الأمامية والخلفي...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization at JoVE.com

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

يصف هذا البروتوكول ثلاث خطوات لإعداد الفصوص البصرية لليرقات وذبابة الفاكهة البالغة للتصوير: 1) تشريح الدماغ ، 2) الكيمياء الهيستولوجية المناعية و 3) التركيب. يتم التركيز على الخطوة 3 ، حيث يلزم وجود اتجاهات تركيب مميزة لتصور هياكل الفص البصري المحددة.

تشريح وكيمياء الهيستولوجية المناعية وتركيب أدمغة ذبابة الفاكهة اليرقية والبالغة لتصور الفص البصري

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

وصفنا بروتوكولا لتشريح أدمغة ذبابة الفاكهة وصبغها المناعي وجبل اليرقات والبالغين مع التركيز بشكل خاص على الفصوص البصرية. بالنظر إلى التنظيم ثلاثي الأبعاد المعقد للفص البصري ، من المتوقع أن يوفر البروتوكول الموصوف هنا للباحثين فهما أكبر للعلاقة بين اتجاه التركيب وهياكل الفص البصري المرئية. يصف هذا البروتوكول ثلاث استراتيجيات تركيب لكل من الفصوص البصرية اليرقية والبالغة ، كل منها يوفر زاوية مثالية لتصور بنية فص بصري معينة أثناء التصوير.قبل البدء في التشريح ، املأ جميع آبار صفيحة الآبار الثلاثة ب 400 ميكرولتر من PBS لكل بئر ، واستخدم الملقط لاختيار 15 يرقة ثالثة متجولة تزحف برفق داخل قارورة أو زجاجة ذبابة الفاكهة. ضع جميع اليرقات في البئر الأول من صفيحة الآبار الثلاثة ، وانقل يرقة واحدة إلى البئر الأوسط للوحة. باستخدام اليد غير المهيمنة ، قم بتقييد جسم اليرقة عند قاعدة البئر واستخدم اليد المهيمنة للإمساك برفق بخطاف فم اليرقة.اسحب خطاف الفم بعيدا عن الجسم لإزالة الدماغ. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الملحقة ، بما في ذلك الأقراص الوهمية. ثم ضع الدماغ في البئر الثالث من اللوحة.عندما يتم تشريح جميع الأدمغة ، استخدم ماصة P200 لإزالة PBS بعناية من البئر الثالث ، تاركا حلا كافيا لإبقاء الدماغ مغمورا. أضف 500 ميكرولتر من محلول التثبيت البارد الطازج إلى البئر. حرك المحلول برفق بالملقط حتى يدور الدماغ في الطبق ، وقم بتغطية البئر بشريحة مجهر زجاجية.ثم ضع الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة لإصلاح الأنسجة. اغسل العقول خمس مرات باستخدام 400 ميكرولتر من PBS الطازج بالإضافة إلى تريتون لكل غسلة. الأدمغة جاهزة الآن لحضانة الأجسام المضادة الأولية.بالنسبة لتشريح دماغ البالغين ، قم بتخدير 10 إلى 15 ذبابة بالغة ووضعها في المختبر فوق الثلج. استخدم ملقط لنقل ذبابة بالغة برفق من الجناح إلى بئر واحد من لوحة تشريح ثلاثة آبار تحتوي على 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. استخدم زوجا من الملقط في اليد غير المهيمنة لتثبيت صدر الذبابة على قاعدة البئر ، واستخدم ملقط فائق الدقة باليد المهيمنة لسحب الرأس برفق من بقية الجسم.تخلص من الجسم على مناديل المختبر باليد غير المهيمنة واستخدم اليد المهيمنة لتثبيت الرأس على قاعدة البئر بواسطة خرطوم. استخدم كلا الملقط لتقشير كل منطقة من بشرة بين العينين ، حتى ينكشف الدماغ ، وإزالة أي أنسجة ملحقة تظل ملتصقة بالدماغ. ضع الدماغ النظيف في البئر الثالث وقم بتشريح الدماغ التالي كما هو موضح ، حتى يتم الحصول على 15 دماغا ، أو انقضاء فترة تشريح قصوى تبلغ 30 دقيقة.ثبت الأدمغة ب 500 ميكرولتر من محلول التثبيت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل الأدمغة خمس مرات باستخدام PBS plus triton ، كما هو موضح. أدمغة البالغين جاهزة الآن لحضانة الأجسام المضادة الأولية. استبدل الغسلة الأخيرة بقطرتين من وسيط التركيب الآمن الفلوري لغمر الأدمغة ، وأضف قطرة واحدة من وسيط التثبيت إلى وسط شريحة مجهر زجاجي جديدة.استخدم ملقط للإمساك بكل دماغ يرقيري بواسطة الحبل العصبي البطني لنقله إلى الشريحة. لتصور السلف والخلايا العصبية من المنطقة المركزية لمركز الانتشار الخارجي ، الصفيحة أو سدادة الفصيص ، تأكد من أن الحبل العصبي البطني يبرز فوق الفصوص ، ضع أدمغة اليرقات على الشريحة مع توجيه الجانب الأمامي من الأنسجة لأعلى. لتصور الخلايا التي تنتمي إلى أطراف مراكز الانتشار الخارجية أو الداخلية ، تأكد من أن الحبل العصبي البطني يخرج من تحت الفصوص.ضع أدمغة اليرقات على الشريحة بحيث يكون الجانب الخلفي من الأنسجة متجها لأعلى. لتصور هلال الخلايا العصبية من مراكز الانتشار الداخلية والخارجية في كل من المحور الجانبي البطني الظهري والإنسي ، استخدم زوجا من الملقط الحاد أو إبرة التنغستن لتقسيم فصوص الدماغ لأسفل عبر الحبل العصبي البطني ، بدءا من نقطة الانقسام بين الفصوص. أعد توجيه كل فص بحيث يكون الجانب الجانبي متجها لأعلى.عندما تكون أدمغة اليرقات موجهة بشكل مناسب ، ضع قطرة صغيرة من الوسائط المتصاعدة على جانبي الدماغ. ضع زلة غطاء واحدة على كل قطرة ، وضع زلة غطاء نهائية على الأدمغة بحيث تستقر الحواف اليمنى واليسرى على زلتي الغطاء الأخريين ، لتشكيل جسر انزلاق الغطاء. ثم استخدم طلاء الأظافر لإغلاق حواف جسر انزلاق الغطاء لتأمين الأدمغة المركبة.بعد آخر غسل ثانوي للأجسام المضادة ، قم بإجراء غسل نهائي باستخدام 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. استبدل PBS بثلاث قطرات من وسيط التركيب الآمن للفلورسنت لغمر الأدمغة. أضف قطرة من وسائط التركيب إلى الثلثين الأيسر والأيمن من شريحة المجهر الزجاجي.ضع غطاء منزلق فوق كل قطرة لبناء جسر انزلاق غطاء. أغلق الحواف الخارجية لانزلاق الغطاء الأيمن بطلاء الأظافر وأضف قطرة واحدة من وسائط التثبيت بين زلات الغطاء. باستخدام الملقط ، انقل العقول برفق إلى الشريحة بحذر إضافي لمنع إتلاف الفصوص البصرية.لتصور أجسام خلايا الصفيحة والخلايا العصبية النخاعية ، استخدم إبرة التنغستن لتوجيه الأدمغة في وضع أمامي مع بروز فصوص الهوائي للخارج. لتصور الخلايا العصبية لمجمع الفصيص ، قم بتوجيه الأدمغة في الخلف مع توجيه فصوص الهوائي لأسفل مقابل موضع الانزلاق. لتصور جميع الخلايا العصبية للفص البصري في مستوى واحد ، قم بتوجيه الأدمغة في وضع أفقي ، واصطف الأدمغة في حامل أمامي ، ثم استخدم إبرة التنغستن لتدوير كل دماغ 90 درجة لأعلى بحيث يجلس على جانبه البطني ، ويستريح على حافة انزلاق الغطاء.عندما يتم توجيه أدمغة البالغين بشكل مناسب ، ضع غطاء نهائيا على الأدمغة بحيث تتداخل الحواف اليمنى واليسرى مع زلتي الغطاء الأخريين لتشكيل جسر ، وختم الشريحة بطلاء الأظافر. فيما يلي صورة لفص بصري يرقي في اتجاه التركيب الأمامي. في اتجاه التركيب الأمامي ، تظهر ظهارة مركز الانتشار المركزي الأعلى صوتا ، والخلايا العصبية النخاعية والخلايا العصبية الصفيحية على السطح كمجموعات من الخلايا التي تلتف حول الدماغ.في عمق الدماغ ، في منتصف مكدس Z ، تكون ظهارة مركز الانتشار الخارجي الرئيسي والخلايا العصبية والخلايا العصبية الخاصة بها مرئية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر ظهارة مركز الانتشار الداخلي والخلايا العصبية لسدادة الفصيصة في هذه الشرائح الوسيطة. تصور أعمق شرائح Z الجانب الآخر من الدماغ حيث توجد الأطراف الخلفية لمركز الانتشار الخارجي.الطرف السطحي لمركز الانتشار الداخلي موجود أيضا. لاحظ أن هذه ستكون أول الهياكل المرئية إذا تم تركيب الفص البصري خلفيا. هذه صورة من فص بصري مثبت على جانبه.على سطح الحامل الجانبي ، يكون هلال الصفيحة مرئيا ويقع هلال سدادة الفصيص بين ذراعيه. يظهر الهلال العصبي النخاعي في موضع Z أعمق قليلا. هذه صورة لفص بصري بالغ مثبت في اتجاه أمامي.نظرا لأن النخاع يقع على سطح الحامل الأمامي ، فإن قشرة النخاع تكون مرئية على الفور. تقوم أجسام الخلايا في القشرة بإسقاط تشجيراتها في neuropil ، والتي يمكن تصورها في موضع Z وسيط. يظهر الفصيص أيضا في هذا المستوى ، موجها بشكل عمودي على النخاع.في أعمق موضع Z ، العصب النهائي للفص البصري ، تكون صفيحة الفصيص مرئية. لاحظ أن صفيحة الفصيص ستكون أول هيكل مرئي في الحامل الخلفي. فيما يلي صورة لفص بصري بالغ مثبت في اتجاه أفقي.عندما ينقلب الدماغ 90 درجة على جانبه إلى وضع أفقي ، تكون جميع الخلايا العصبية والقشرية في الفص البصري مرئية في مستوى واحد. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، فإن أهم شيء يجب تذكره هو الحفاظ على أنسجة المخ مغمورة في محلول طوال البروتوكول. إذا تعرضت الأدمغة للهواء ، فإن جودة البقعة ، وبالتالي ، سيتم تقليل الصور النهائية بشكل كبير.يعد فهم كيفية تأثير اتجاه التركيب على تصور الفص البصري أمرا مهما للتصوير الحي. يمكن زراعة أدمغة اليرقات والبالغين وتصويرها على مدار عدة أيام لمتابعة انقسامات الخلايا أو التغيرات في مورفولوجيتك الخاصة. هنا ، يعد اتجاه التركيب أمرا بالغ الأهمية ، حيث يجب أن تكون أنواع الخلايا ذات الأهمية قريبة من انزلاق الغطاء للكشف الأمثل عن إشارة الفلورسنت في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

نموذج إصابة جرح الطعنة للتكتوم البصري البالغ باستخدام الزرد و Medaka للتحليل المقارن للقدرة التجديدية

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...