Name: dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization at JoVE.com

Vi vil gerne takke Claude Desplan for at dele en alikvot af Bsh-antistoffet med os. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up og Bruchpilot monoklonale antistoffer blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af NICHD of NIH og vedligeholdt ved University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Dette arbejde blev støttet af et NSERC Discovery Grant tildelt T.E. UA støttes af et NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship. P.V. støttes af et Ontario Graduate Scholarship.

1. Forberedelse af larvehjerner til konfokal billeddannelse
<ol><li>Dissektioner BEMÆRK VENLIGST: Før dissektionen påbegyndes, skal du forberede fix (4 % formaldehyd i fosfatbufret saltvand (PBS)) og PBT (0.1-0.3 % Triton i PBS) opløsninger. Fixopløsningen skal placeres på is under dissektionen. Selvom paraformaldehyd (PFA) fikseringsmiddel bruges i denne protokol, er alternative fikseringsstrategier (ved hjælp af PLP20 eller PEM21) blevet beskr...

<ol>
	<li>Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure.">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell Tissue Research. 258, (1989).</li><li>Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+and+early+differentiation+of+the+optic+lobes+in+Drosophila+melanogaster.">Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).</li><li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Insect+and+Vertebrate+Visual+Systems.">Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems.</a> Neuron. 66, 15-36 (2010).</li><li>N&#233;riec, N., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Eye+to+the+Brain.+Development+of+the+Drosophila+Visual+System.">From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 247-271 (2016).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Challenge+of+Numbers+and+Diversity:+Neurogenesis+in+the+Drosophila+Optic+Lobe.">A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe.</a> Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).</li><li>Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+the+generation+of+neuronal+diversity:+Lessons+from+the+fly+visual+system.">Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140 (2019).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Role+of+the+Vsx+Genes+Supports+a+Monophyletic+Origin+for+Bilaterian+Visual+Systems.">Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems.</a> Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+evolution+at+high+resolution:+The+neuron+as+a+unit+of+homology.">Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology.</a> Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+projection+neurons+in+the+Drosophila+lobula+link+feature+detection+to+distinct+behavioral+programs.">Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+pattern+of+neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+visual+system:+A+user's+guide+to+the+dynamic+morphology+of+the+developing+optic+lobe.">Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe.</a> Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+Drosophila+medulla+neuroblasts+controls+neural+fates.">Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates.</a> Nature. 498, 456-462 (2013).</li><li>Erclik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+temporal+and+spatial+patterning+generates+neural+diversity.">Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity.</a> Nature. 541, 365-370 (2017).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+region-specific+neurogenesis+mode+requires+migratory+progenitors+in+the+Drosophila+visual+system.">A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system.</a> Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).</li><li>Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+mechanism+that+produces+neuronal+diversity+in+the+Drosophila+visual+center.">A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center.</a> Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).</li><li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe.">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li><li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless/Pax6.">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li><li>Millard, S. S., Pecot, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+assembling+columns+and+layers+in+the+Drosophila+visual+system.">Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system.</a> Neural Development. 13, 1-17 (2018).</li><li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe:+The+input+terminals+to+the+medulla.">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li><li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation.">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li><li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+drosophila+melanogaster.">Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51792 (2014).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, 4139-4147 (1996).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval,+pupal+and+adult+Drosophila+retinas.">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> Journal of visualized experiments. , e4347 (2012).</li><li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains.">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174 (2017).</li><li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936 (2010).</li><li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper.">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li><li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit.">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li><li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts.">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756 (2014).</li><li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers.">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410 (2017).</li><li>&#214;zel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

I denne protokol beskriver vi en metode til at immunfarve larve- og voksne Drosophila-hjerner og montere dem i flere retninger. Mens metoder til at farve larve- og voksne hjerner tidligere er blevet beskrevet 22,23,24,27,28, har monteringsstrategier for optimal visualisering af specifikke optiske lapstrukturer fået mindre opmærksomhed28...

Drosophilas visuelle system, der består af det sammensatte øje og den underliggende synslap, har været en fremragende model for studiet af neurale kredsløbs udvikling og funktion. I de senere år er især den optiske lap dukket op som et kraftfuldt system til at studere neuroudviklingsprocesser såsom neurogenese og kredsløbsledninger 1,2,3,4,5,6,7,8. Den består af fire neuropils: lamina, medulla, lobula og lobula-plade (de to sidstnævnte udgør lobula-komplekset)1,2,3,4,5,6. Fotoreceptorer fra øjet er rettet mod neuroner i lamina og medulla, som behandler visuelle input og videresender dem til neuropillerne i lobula-komplekset 1,2,3,4,5,6. Projektionsneuroner i lobula-komplekset sender efterfølgende visuel information til de højere ordens behandlingscentre i den centrale hjerne 1,5,9. Den komplekse organisering af den optiske lap, der er nødvendig af et behov for at opretholde retinotopi og behandle forskellige typer visuelle stimuli, gør den til et attraktivt system til at studere, hvordan sofistikerede neurale kredsløb er samlet. Især deler medulla slående ligheder i både sin organisation og udvikling med neuronethinden, som længe har været en model for udvikling af hvirveldyrs neurale kredsløb 3,8.
Udviklingen af synslob begynder under embryogenese med specifikationen af ~35 ektodermale celler, der danner den optiske plakode 2,4,5,6,7,8. Efter larveudklækning er den optiske placode opdelt i to forskellige primordia: 1) det ydre proliferationscenter (OPC), som genererer neuronerne i lamina og ydre medulla og 2) det indre proliferationscenter (IPC), som genererer neuroner i det indre medulla og lobula kompleks 4,5,6,10 . I den sene næst-instar-larve begynder neuroepitelcellerne i OPC og IPC at omdanne sig til neuroblaster, der efterfølgende genererer neuroner via mellemliggende gangliemoderceller 4,5,11,12. Neuroblaster i optiske lapper er mønstret af rumligt og tidsmæssigt begrænsede transkriptionsfaktorer, som virker sammen for at generere neural diversitet i deres afkom 11,12,13,14. I puppen samles kredsløbene i de optiske lap-neuropile via koordinering af flere processer, herunder programmeret celledød11,15, neuronal migration12,16, aksonal/dendritisk målretning10,17, synapsedannelse18,19 og neuropilrotationer10,17.
Her beskriver vi den metode, hvormed larve- og voksne hjerner dissekeres, immunfarves og monteres til billeddannelse af synslapsen. I betragtning af dens komplekse tredimensionelle organisation kræver analyse af synslapsen, at man forstår, hvordan dens voksne neuropils og larveforfædre er placeret i forhold til hinanden og den centrale hjerne. Derfor lægger vi særlig vægt på, hvordan orienteringen af monteringen relaterer sig til den rumlige organisering af de optiske lapstrukturer. Vi beskriver tre monteringsstrategier for larvehjerner (forreste, posteriore og laterale) og tre for voksne hjerner (forreste, bageste og horisontale), som hver giver en optimal vinkel til at afbilde en specifik optiklapsstampopulation eller neuropil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1077px;" width="1077">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">10x PBS</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">PBS405</td>
			<td style="width:357px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">37% formaldehyde</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">FOR201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 488 (goat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11055</td>
			<td>use at 1:501</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 555 (mouse) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-31570</td>
			<td>use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21450</td>
			<td>use at 1:503</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (rat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21247</td>
			<td>use at 1:502</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Cover slips</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #5</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #55</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissection Dish</td>
			<td style="width:325px;">Corning</td>
			<td>722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dry wipes</td>
			<td style="width:325px;">Kimbery Clark</td>
			<td style="width:164px;">34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Goat anti-Bgal primary antibody</td>
			<td>Biogenesis</td>
			<td></td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Bsh primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Gift from Claude Desplan</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Erclik et al. 2008</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:325px;">Parfilm</td>
			<td style="width:164px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:325px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:164px;">72.706.600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">CA4823-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-dac primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:164px;">mabdac2-3</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-eya primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">eya10H6</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-nc82 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">nc82</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-svp primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">Seven-up 2D3</td>
			<td>use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Polymer Clay</td>
			<td>Any type of clay can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11122</td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rat anti-DE-Cadherin primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">DCAD2</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Slowfade mounting medium</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">S36967</td>
			<td>Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization

Drosophila-optiklappen, der består af fire neuropils: lamina, medulla, lobula og lobula-plade, er et fremragende modelsystem til at udforske de udviklingsmekanismer, der genererer neural diversitet og driver kredsløbssamling. I betragtning af dens komplekse tredimensionelle organisation kræver analyse af synslapsen, at man forstår, hvordan dens voksne neuropils og larveforfædre er placeret i forhold til hinanden og den centrale hjerne. Her beskriver vi en protokol for dissektion, immunfarvning og montering af larve- og voksenhjerner til billeddannelse af synslob. Der lægges særlig vægt på forholdet mellem monteringsorientering og den rumlige organisering af synsloben. Vi beskriver tre monteringsstrategier i larven (forreste, bageste og laterale) og tre i den voksne (forreste, bageste og vandrede), som hver giver en ideel billedvinkel for en distinkt synslapstruktur.

Konfokale billeder af larver og voksne optiske lapper monteret i de retninger, der er beskrevet i protokollen, er vist i figur 1 og figur 2.
Figur 1 viser skemaer og repræsentative konfokale skiver af larvehjerner placeret i forreste, bageste og laterale orienteringer. I den forreste monteringsorientering vises OPC-epitelet (DE-Cadherin), medulla-neuroblaster (deadpan>βgal) og lamina-neuroner (...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization at JoVE.com

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Denne protokol beskriver tre trin til at forberede larver og voksne Drosophila optiske lapper til billeddannelse: 1) hjernedissektioner, 2) immunhistokemi og 3) montering. Der lægges vægt på trin 3, da der kræves tydelige monteringsretninger for at visualisere specifikke optiske lapstrukturer.

Dissektion, immunhistokemi og montering af larve- og voksne Drosophila-hjerner til visualisering af synslob

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Vi beskriver en protokol til dissekering, immunfarvning og montering af larve- og voksne Drosophila-hjerner med særlig vægt på de optiske lapper. I betragtning af optiklappens komplekse tredimensionelle organisation forventes det, at den protokol, der er beskrevet her, vil give forskerne en større forståelse af forholdet mellem monteringsorientering og de visualiserede optiske lapstrukturer. Denne protokol beskriver tre monteringsstrategier for både larver og voksne optiske lapper, som hver giver en optimal vinkel til at visualisere en specifik optisk lapstruktur under billeddannelse.Før dissektionen påbegyndes, skal du fylde alle brønde i en tre-brønds plade med 400 mikroliter PBS pr. brønd, og bruge pincet til forsigtigt at udvælge 15 vandrende tredje instar-larver, der kravler på indersiden af et drosophila-hætteglas eller -flaske. Placer alle larver i den første brønd af de tre brøndplader, og overfør en larve til den midterste brønd af pladen. Brug den ikke-dominerende hånd til at fastholde larvens krop ved bunden af brønden og brug den dominerende hånd til forsigtigt at tage fat i larvens mundkrog.Træk mundkrogen væk fra kroppen for at fjerne hjernen. Fjern derefter tilbehørsvævene, inklusive de imaginære skiver. Placer derefter hjernen i pladens tredje brønd.Når alle hjerner er blevet dissekeret, skal du bruge en P200-pipette til forsigtigt at fjerne PBS fra den tredje brønd, så der er lige nok opløsning tilbage til at holde hjernen nedsænket. Tilsæt 500 mikroliter frisklavet kold fikseringsopløsning til brønden. Rør forsigtigt opløsningen med pincet, så hjernen hvirvler i skålen, og dæk brønden med et glasmikroskopglas.Læg derefter skålen på is i 30 minutter for at fastgøre vævet. Vask hjernen fem gange med 400 mikroliter frisk PBS plus triton pr. vask. Hjernen er nu klar til primær antistofinkubation.Ved hjernedissektioner hos voksne skal du bedøve 10 til 15 voksne fluer og placere dem på en laboratorieserviet over is. Brug pincet til forsigtigt at overføre en voksen flue ved vingen til en brønd i en dissektionsplade med tre brønde indeholdende 400 mikroliter PBS. Brug en pincet i den ikke-dominerende hånd til at holde fluens brystkasse mod bunden af brønden, og brug ultrafine pincet med den dominerende hånd til forsigtigt at trække hovedet fra resten af kroppen.Kassér kroppen på en laboratorieserviet med den ikke-dominerende hånd, og brug den dominerende hånd til at holde hovedet mod bunden af brønden ved snabelen. Brug begge pincet til at skrælle hvert område af neglebåndet mellem øjnene væk, indtil hjernen er blotlagt, og fjern eventuelt tilbehørsvæv, der forbliver fastgjort til hjernen. Placer den rensede hjerne i den tredje brønd og disseker den næste hjerne som demonstreret, indtil der er opnået 15 hjerner, eller der er gået en maksimal dissektionsperiode på 30 minutter.Fastgør hjernen med 500 mikroliter fikseringsopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur, og vask hjernen fem gange med PBS plus triton, som demonstreret. Voksne hjerner er nu klar til primær antistofinkubation. Udskift den sidste vask med to dråber fluorescerende sikkert monteringsmedium for at nedsænke hjernen, og tilføj en enkelt dråbe monteringsmedium til midten af et nyt glasmikroskopglas.Brug pincet til at gribe fat i hver larvehjerne ved den ventrale nervestreng for overførsel til slæden. For at visualisere forfædre og neuroner fra den centrale region af det ydre spredningscenter, Lamina eller lobula plug, skal du sikre dig, at den ventrale nervestreng rager ud over lapperne, placere larvehjernen på objektglasset med den forreste side af vævet opad. For at visualisere celler, der tilhører spidserne af de ydre eller indre proliferationscentre, skal du sikre dig, at den ventrale nervestreng stikker ud under lapperne.Placer larvehjernen på objektglasset med den bageste side af vævet opad. For at visualisere halvmånen af neuroner fra de indre og ydre proliferationscentre i både den dorsale ventrale og mediale laterale akse, skal du bruge en skarp pincet eller en wolframnål til at opdele hjernelapperne ned gennem den ventrale nervestreng, startende fra spaltningspunktet mellem lapperne. Drej hver lap igen med sidesiden opad.Når larvehjernerne er blevet orienteret korrekt, placeres en lille dråbe monteringsmedier på hver side af hjernen. Placer en dækseddel på hver dråbe, og læg en sidste dækseddel over hjernen, så højre og venstre kant hviler på de to andre dækglas og danner en dækbro. Brug derefter neglelak til at forsegle kanterne på dækslæbbroen for at fastgøre de monterede hjerner.Efter den sidste sekundære antistofvask udføres en sidste vask med 400 mikroliter PBS. Udskift PBS med tre dråber fluorescerende sikkert monteringsmedium for at nedsænke hjernen. Tilføj en dråbe monteringsmedier til venstre og højre tredjedel af et glasmikroskopglas.Placer en dækslip over hver dråbe for at bygge en dækbro. Forsegl yderkanterne af den højre dækglas med neglelak og tilsæt en enkelt dråbe monteringsmedier mellem dækglassene. Brug pincet til forsigtigt at overføre hjernen til objektglasset med ekstra forsigtighed for at forhindre at beskadige synslapperne.For at visualisere cellelegemerne i lamina- og medulla-neuronerne skal du bruge en wolframnål til at orientere hjernen i en forreste position med antennelapperne stikkende udad. For at visualisere neuroner i lobula-komplekset skal du orientere hjernen i en bageste med antennallapperne vendt nedad mod glidepositionen. For at visualisere alle synslapsneuropile i et enkelt plan, skal du orientere hjernen i vandret position, stille hjernen op i en forreste montering og derefter bruge en wolframnål til at rotere hver hjerne 90 grader opad, så den sidder på sin ventrale side og hviler på kanten af dækglasset.Når de voksne hjerner er blevet orienteret korrekt, skal du placere en sidste dækglas over hjernen, så højre og venstre kant overlapper med de to andre dækglas for at danne en bro, forsegle objektglasset med neglelak. Her er et billede af en larveoptisk lap i den forreste monteringsretning. I den forreste monteringsorientering vises epitelet i det centrale højere proliferationscenter, medulla neuroblast og lamina neuroner på overfladen som bånd af celler, der vikler sig rundt om hjernen.Dybere inde i hjernen, i midten af Z-stakken, er det vigtigste ydre proliferationscenterepitel og dets respektive neuroblast og neuroner synlige. Derudover er epitelet i det indre proliferationscenter og neuroner i lobula-stikket synlige i disse mellemliggende skiver. De dybeste Z-skiver viser den anden side af hjernen, hvor de bageste spidser af det ydre spredningscenter er placeret.Den overfladiske spids af det indre spredningscenter er også til stede. Bemærk, at disse ville være de første strukturer, der var synlige, hvis den optiske lap blev monteret bagud. Her er et billede fra en optisk lap monteret på siden.På overfladen af sidemonteringen er laminahalvmånen synlig, og lobula-proppens halvmåne er placeret mellem armene. Medulla neuronal halvmåne vises i en lidt dybere Z-position. Her er et billede af en voksen optisk lap monteret i en forreste retning.Da medulla er placeret på overfladen af den forreste montering, er medulla cortex umiddelbart synlig. Cellelegemer i cortex projicerer deres arboriseringer ind i neuropilen, som kan visualiseres i en mellemliggende Z-position. Lobula vises også på dette niveau, orienteret vinkelret på medulla.Ved den dybeste Z-position, den sidste neuropil i synsloben, er lobulapladen synlig. Bemærk, at lobulapladen ville være den første struktur, der er synlig i en bageste montering. Her er et billede af en voksen optisk lap monteret i vandret retning.Når hjernen vendes 90 grader på siden til en vandret position, er alle neuropils og cortices i synsloben synlige i et enkelt plan. Når du udfører denne protokol, er det vigtigste at huske at holde hjernevævet nedsænket i opløsning gennem hele protokollen. Hvis hjernen udsættes for luft, vil plettens kvalitet og derfor de endelige billeder blive reduceret betydeligt.En forståelse af, hvordan monteringsorientering påvirker visualisering af optiske lober, er vigtig for live billeddannelse. Larve- og voksne hjerner kan dyrkes og afbildes over flere dage for at følge celledelinger eller ændringer i din egen morfologi. Her er monteringsretningen kritisk, da de relevante celletyper skal være tæt på dækglasset for optimal detektion af det fluorescerende signal in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissektion af Larver zebrafisk gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisering og analyse af Pharyngeal Arch Arterier ved hjælp af fuld-mount Immunohistochemistry og 3D Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Præparat af Drosophila Larve og Pupal Testikler til analyse af celledeling i Levende, Intakt væv

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

En protokol til immunohistokemi og RNA in situ-distribution inden for tidligt drosophila-embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissektion og levende billeddannelse af den sene embryonale Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Stiksårskademodel af voksenoptisk tektum ved hjælp af zebrafisk og medaka til sammenlignende analyse af regenerativ kapacitet

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...