Name: dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00
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Bsh 항체의 부분 표본을 공유해 주신 Claude Desplan에게 감사드립니다. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up 및 Bruchpilot 단클론 항체는 NIH의 NICHD에 의해 만들어지고 아이오와 대학교 생물학과, 아이오와 시티, IA 52242에서 유지 관리되는 발달 연구 하이브리도마 은행에서 획득되었습니다. 이 연구는 T.E.에게 수여된 NSERC 디스커버리 그랜트(NSERC Discovery Grant)의 지원을 받았습니다. U.A.는 NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship의 지원을 받습니다. PV는 온타리오 대학원 장학금의 지원을 받습니다.

1. 컨포칼 이미징을 위한 유충 뇌 준비
<ol><li>해부 참고: 해부를 시작하기 전에 수정액(인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 포름알데히드) 및 PBT(PBS의 0.1-0.3% 트리톤) 용액을 준비하십시오. 수정 용액은 해부 중에 얼음 위에 놓아야 합니다. 이 프로토콜에서는 파라포름알데히드(PFA) 고정제가 사용되지만, 특정 에피토프에 대한 대체 고정 전략(PLP20 또는 PEM21</su...

<ol>
	<li>Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure.">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell Tissue Research. 258, (1989).</li><li>Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+and+early+differentiation+of+the+optic+lobes+in+Drosophila+melanogaster.">Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).</li><li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Insect+and+Vertebrate+Visual+Systems.">Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems.</a> Neuron. 66, 15-36 (2010).</li><li>N&#233;riec, N., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Eye+to+the+Brain.+Development+of+the+Drosophila+Visual+System.">From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 247-271 (2016).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Challenge+of+Numbers+and+Diversity:+Neurogenesis+in+the+Drosophila+Optic+Lobe.">A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe.</a> Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).</li><li>Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+the+generation+of+neuronal+diversity:+Lessons+from+the+fly+visual+system.">Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140 (2019).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Role+of+the+Vsx+Genes+Supports+a+Monophyletic+Origin+for+Bilaterian+Visual+Systems.">Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems.</a> Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+evolution+at+high+resolution:+The+neuron+as+a+unit+of+homology.">Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology.</a> Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+projection+neurons+in+the+Drosophila+lobula+link+feature+detection+to+distinct+behavioral+programs.">Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+pattern+of+neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+visual+system:+A+user's+guide+to+the+dynamic+morphology+of+the+developing+optic+lobe.">Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe.</a> Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+Drosophila+medulla+neuroblasts+controls+neural+fates.">Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates.</a> Nature. 498, 456-462 (2013).</li><li>Erclik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+temporal+and+spatial+patterning+generates+neural+diversity.">Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity.</a> Nature. 541, 365-370 (2017).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+region-specific+neurogenesis+mode+requires+migratory+progenitors+in+the+Drosophila+visual+system.">A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system.</a> Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).</li><li>Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+mechanism+that+produces+neuronal+diversity+in+the+Drosophila+visual+center.">A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center.</a> Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).</li><li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe.">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li><li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless/Pax6.">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li><li>Millard, S. S., Pecot, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+assembling+columns+and+layers+in+the+Drosophila+visual+system.">Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system.</a> Neural Development. 13, 1-17 (2018).</li><li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe:+The+input+terminals+to+the+medulla.">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li><li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation.">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li><li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+drosophila+melanogaster.">Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51792 (2014).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, 4139-4147 (1996).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval,+pupal+and+adult+Drosophila+retinas.">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> Journal of visualized experiments. , e4347 (2012).</li><li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains.">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174 (2017).</li><li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936 (2010).</li><li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper.">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li><li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit.">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li><li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts.">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756 (2014).</li><li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers.">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410 (2017).</li><li>&#214;zel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

이 프로토콜에서는 유충 및 성체 초파리의 뇌를 면역염색하고 여러 방향으로 장착하는 방법을 설명합니다. 유충과 성충의 뇌를 염색하는 방법은 이전에 설명되었지만22,23,24,27,28 특정 시신경 구조를 최적으로 시각화하기 위한 장착 전략은 주목을 덜 받았다 <sup class="x...

겹눈과 기저 시신경엽으로 구성된 초파리 시각 시스템은 신경 회로 발달 및 기능 연구를 위한 훌륭한 모델이었습니다. 최근 몇 년 동안 특히 시신경엽은 신경 발생 및 회로 배선 1,2,3,4,5,6,7,8과 같은 신경 발달 과정을 연구하는 강력한 시스템으로 부상했습니다. 그것은 4 개의 신경 필로 구성됩니다 : lamina, medulla, lobula 및 lobula plate (후자의 두 개는 소엽 복합체를 구성)1,2,3,4,5,6. 눈의 광수용체는 박판(lamina)과 수질(medulla)의 뉴런을 표적으로 하여 시각적 입력을 처리하고 소엽 복합체 1,2,3,4,5,6의 뉴로pils로 전달합니다. 소엽 복합체(lobula complex)의 투영 뉴런(projection neuron)은 이후 시각 정보를 중추 뇌(central brain) 1,5,9의 고차원 처리 센터로 보냅니다. 시신경의 복잡한 조직은 망막근시를 유지하고 다양한 유형의 시각적 자극을 처리해야 할 필요성에 의해 필요하기 때문에 정교한 신경 회로가 어떻게 조립되는지 연구하는 데 매력적인 시스템입니다. 특히, 수질은 오랫동안 척추 신경 회로 발달의 모델이었던 신경 망막과 그 조직과 발달 모두에서 놀라운 유사성을 공유합니다 3,8.
시신경 엽 발달은 배아 발생 중에 시작되며, 시신경 플라코드 2,4,5,6,7,8을 형성하는 ~35개의 외배엽 세포의 사양이 지정됩니다. 유충 부화 후, 시포는 두 개의 뚜렷한 원시골로 세분됩니다: 1) 층막과 외골의 뉴런을 생성하는 외부 증식 센터(OPC)와 2) 내부 수질과 소엽 복합체 4,5,6,10의 뉴런을 생성하는 내부 증식 센터(IPC). 후기 2차 인스타 유충에서 OPC 및 IPC의 신경 상피 세포는 신경 아세포로 변형되기 시작하여 중간 신경절 모세포 4,5,11,12를 통해 신경 세포를 생성합니다. 시신경 엽 신경 아세포는 공간적 및 시간적으로 제한된 전사 인자에 의해 패턴화되며, 이들은 함께 작용하여 자손에서 신경 다양성을 생성합니다 11,12,13,14. 번데기에서 시신경 엽의 회로는 프로그램 된 세포 사멸11,15, 신경 세포 이동12,16, 축삭 / 수지상 표적10,17, 시냅스 형성(18,19) 및 신경 필 회전10,17을 포함한 여러 과정의 조정을 통해 조립됩니다.
여기에서는 유충과 성충의 뇌를 절개하고, 면역 염색하고, 시신경엽을 이미징하기 위해 장착하는 방법을 설명합니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 따라서 우리는 장착 방향이 시신경엽 구조의 공간 조직과 어떻게 관련되는지에 특히 중점을 둡니다. 유충 뇌(전방, 후방 및 측방)를 위한 세 가지 장착 전략과 성체 뇌를 위한 세 가지 장착(전방, 후방 및 수평)을 설명하며, 각 전략은 특정 시신경엽 전구 개체군 또는 신경생물을 이미징하기 위한 최적의 각도를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1077px;" width="1077">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">10x PBS</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">PBS405</td>
			<td style="width:357px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">37% formaldehyde</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">FOR201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 488 (goat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11055</td>
			<td>use at 1:501</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 555 (mouse) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-31570</td>
			<td>use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21450</td>
			<td>use at 1:503</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (rat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21247</td>
			<td>use at 1:502</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Cover slips</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #5</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #55</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissection Dish</td>
			<td style="width:325px;">Corning</td>
			<td>722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dry wipes</td>
			<td style="width:325px;">Kimbery Clark</td>
			<td style="width:164px;">34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Goat anti-Bgal primary antibody</td>
			<td>Biogenesis</td>
			<td></td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Bsh primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Gift from Claude Desplan</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Erclik et al. 2008</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:325px;">Parfilm</td>
			<td style="width:164px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:325px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:164px;">72.706.600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">CA4823-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-dac primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:164px;">mabdac2-3</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-eya primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">eya10H6</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-nc82 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">nc82</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-svp primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">Seven-up 2D3</td>
			<td>use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Polymer Clay</td>
			<td>Any type of clay can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11122</td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rat anti-DE-Cadherin primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">DCAD2</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Slowfade mounting medium</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">S36967</td>
			<td>Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization

초파리 시신경엽( Drosophila optic lobe)은 4개의 신경세포(lamina, medulla, lobula 및 lobula plate)로 구성되어 있으며, 신경 다양성을 생성하고 회로 조립을 주도하는 발달 메커니즘을 탐구하기 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 여기에서는 시신경 이미징을 위한 유충 및 성충 뇌의 절개, 면역 염색 및 장착을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 장착 방향과 시신경엽의 공간 조직 사이의 관계에 특히 중점을 둡니다. 유충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 측방)과 성충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 수평)에 대해 설명하며, 각 전략은 뚜렷한 시신경 구조를 위한 이상적인 이미징 각도를 제공합니다.

프로토콜에 설명된 방향으로 장착된 유충 및 성체 시신경엽의 공초점 이미지는 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다.
그림 1은 전방, 후방 및 측방 방향으로 위치한 유충 뇌의 개략도와 대표적인 공초점 절편을 보여줍니다. 전방 장착 방향에서는 OPC 상피(DE-Cadherin), 수질 신경아세포(deadpan>βgal) 및 층판 뉴?...

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Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

우리는 시신경엽에 특히 중점을 두고 유충 및 성체 초파리의 뇌를 절개, 면역 염색 및 장착하는 프로토콜을 설명합니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 여기에 설명된 프로토콜은 연구자들이 장착 방향과 시각화된 시신경엽 구조 간의 관계를 더 잘 이해할 수 있도록 할 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜은 유충 및 성체 시신경엽에 대한 세 가지 장착 전략을 설명하며, 각 전략은 이미징 중 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위한 최적의 각도를 제공합니다.해부를 시작하기 전에 3개의 웰 플레이트의 모든 웰을 웰당 400마이크로리터의 PBS로 채우고 집게를 사용하여 초파리 바이알 또는 병 내부를 기어 다니는 15개의 떠돌이 제3 인스타 유충을 부드럽게 선택합니다. 모든 유충을 세 개의 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 놓고 한 유충을 플레이트의 중간 웰로 옮깁니다. 우세하지 않은 손을 사용하여 우물 바닥에서 유충의 몸을 구속하고 우세한 손을 사용하여 유충 입 고리를 부드럽게 잡습니다.입 고리를 몸에서 당겨 뇌를 제거합니다. 그런 다음 상상 디스크를 포함한 부속 조직을 제거합니다. 그런 다음 뇌를 접시의 세 번째 우물에 넣습니다.모든 뇌를 절개한 후에는 P200 피펫을 사용하여 세 번째 웰에서 PBS를 조심스럽게 제거하고 뇌가 물에 잠길 수 있을 만큼의 용액만 남깁니다. 500 마이크로 리터의 갓 준비된 냉간 고정 용액을 우물에 추가하십시오. 뇌가 접시 안에서 소용돌이치도록 집게로 용액을 부드럽게 저어주고 유리 현미경 슬라이드로 우물을 덮습니다.그런 다음 접시를 얼음 위에 30분 동안 올려 티슈를 고정합니다. 세척 당 400 마이크로 리터의 신선한 PBS와 트리톤으로 뇌를 5 번 씻으십시오. 뇌는 이제 1차 항체 배양을 할 준비가 되었습니다.성체 뇌 해부의 경우, 10-15마리의 성체 파리를 마취하고 얼음 위에서 실험실 닦음에 올려 놓습니다. 집게를 사용하여 날개를 가진 성인 파리 한 마리를 400 마이크로 리터의 PBS가 들어있는 3 웰 해부 플레이트의 한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 주로 사용하지 않는 손에 한 쌍의 집게를 사용하여 파리의 흉부를 우물 바닥에 대고 잡고 주로 사용하는 손으로 초미세 집게를 사용하여 몸의 나머지 부분에서 머리를 부드럽게 잡아당깁니다.시체를 실험실에 버리고 우세하지 않은 손으로 닦고 우세한 손을 사용하여 주둥이로 우물 바닥에 머리를 고정합니다. 양쪽 집게를 사용하여 뇌가 노출될 때까지 눈 사이의 큐티클 각 부위를 벗겨내고 뇌에 붙어 있는 부속 조직을 제거합니다. 세척된 뇌를 세 번째 우물에 넣고 15개의 뇌를 얻거나 최대 30분의 절개 시간이 경과할 때까지 시연된 대로 다음 뇌를 절개합니다.500 마이크로리터의 고정 용액으로 상온에서 20분 동안 뇌를 고정하고 시연된 것처럼 PBS와 트리톤으로 뇌를 5회 세척합니다. 성인의 뇌는 이제 1차 항체 배양을 할 준비가 되었습니다. 마지막 세척을 형광 안전 장착 매체 두 방울로 교체하여 뇌를 잠기고 새 유리 현미경 슬라이드의 중앙에 장착 매체 한 방울을 추가합니다.겸자를 사용하여 배쪽 신경삭으로 각 유충의 뇌를 잡고 슬라이드로 전달합니다. 외부 증식 센터의 중앙 영역에서 전구 세포와 뉴런을 시각화하려면 라미나 또는 소엽 플러그를 통해 복부 신경 코드가 엽 위로 돌출되어 있는지 확인하고 유충 뇌를 조직의 앞쪽이 위를 향하도록 슬라이드에 배치합니다. 외부 또는 내부 증식 센터의 끝에 속하는 세포를 시각화하려면 복부 신경삭이 엽 아래에서 돌출되어 있는지 확인하십시오.유충 뇌를 조직의 뒤쪽이 위를 향하도록 슬라이드에 놓습니다. 등쪽 배측 축과 내측 측축의 내부 및 외부 증식 센터에서 뉴런의 초승달 모양을 시각화하려면 한 쌍의 날카로운 집게나 텅스텐 바늘을 사용하여 뇌엽 사이의 절단 지점에서 시작하여 복부 신경삭을 통해 뇌엽을 분할합니다. 측면이 위를 향하도록 각 로브의 방향을 변경합니다.유충의 뇌가 적절하게 방향을 잡았을 때, 뇌의 양쪽에 작은 방울의 장착 매체를 놓습니다. 각 방울에 하나의 커버 슬립을 놓고 마지막 커버 슬립을 뇌 위에 올려 오른쪽과 왼쪽 가장자리가 다른 두 개의 커버 슬립에 놓이도록 하여 커버 슬립 브리지를 형성합니다. 그런 다음 매니큐어를 사용하여 커버 슬립 브리지의 가장자리를 밀봉하여 장착된 브레인을 고정합니다.마지막 2차 항체 세척 후 400마이크로리터의 PBS로 최종 세척을 수행합니다. PBS를 형광 안전 장착 매체 3방울로 교체하여 뇌를 담그십시오. 유리 현미경 슬라이드의 왼쪽과 오른쪽 3분의 1에 장착 매체 한 방울을 추가합니다.각 방울 위에 커버 슬립을 놓아 커버 슬립 브리지를 만듭니다. 오른쪽 커버 슬립의 바깥쪽 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 커버 슬립 사이에 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 겸자를 사용하여 시신경엽이 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여 뇌를 슬라이드로 부드럽게 옮깁니다.얇은 판과 수질 뉴런의 세포체를 시각화하려면 텅스텐 바늘을 사용하여 더듬이 엽이 바깥쪽으로 돌출된 앞쪽 위치에 뇌의 방향을 지정합니다. 소엽 복합체의 뉴런을 시각화하려면 더듬이 엽이 슬라이드 위치에 대해 아래를 향하도록 뇌를 후방으로 배치합니다. 모든 시신경 세포를 단일 평면에서 시각화하려면 뇌를 수평 위치로 향하게하고 뇌를 전방 마운트에 정렬 한 다음 텅스텐 바늘을 사용하여 각 뇌를 위쪽으로 90도 회전시켜 복부 쪽에 앉게하고 커버 슬립의 가장자리에 놓습니다.성인의 뇌가 적절하게 방향을 잡았을 때 오른쪽 및 왼쪽 가장자리가 다른 두 개의 덮개 쪽지와 겹쳐져 다리를 형성하도록 뇌 위에 최종 덮개 쪽지를 놓고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉합니다. 다음은 전방 장착 방향에 있는 유충 시신경엽의 이미지입니다. 전방 장착 방향에서는 중앙 시끄러운 증식 센터의 상피, 수질 신경 아세포 및 층판 뉴런이 뇌를 감싸는 세포 띠로 표면에 나타납니다.뇌 깊숙한 곳, Z-스택의 중앙에는 주요 외부 증식 중심 상피와 각각의 신경 아세포 및 뉴런이 보입니다. 또한, 내부 증식 중심의 상피와 소엽 플러그의 뉴런은 이러한 중간 절편에서 볼 수 있습니다. 가장 깊은 Z 절편은 바깥쪽 증식 센터의 뒤쪽 끝이 위치한 뇌의 다른 쪽을 묘사합니다.내부 증식 센터의 표면 끝부분도 존재합니다. 이것들은 시신경엽이 후방에 장착된 경우 볼 수 있는 첫 번째 구조입니다. 다음은 측면에 장착된 시신경엽의 이미지입니다.측면 마운트의 표면에서 lamina 초승달이 보이고 lobula plug 초승달이 팔 사이에 있습니다. 수질 신경 초승달은 약간 더 깊은 Z 위치에서 나타납니다. 다음은 전방 방향으로 장착된 성인 시신경엽의 이미지입니다.수질은 전방 산의 표면에 위치하기 때문에 수질 피질은 즉시 볼 수 있습니다. 피질의 세포체는 중간 Z 위치에서 시각화할 수 있는 신경pil에 arborizations를 투영합니다. 소엽은 또한 이 수준에서 나타나며 수질에 수직으로 향합니다.시신경엽의 마지막 신경파일인 가장 깊은 Z 위치에서 소엽판을 볼 수 있습니다. lobula plate는 posterior mount에서 볼 수 있는 첫 번째 구조입니다. 다음은 수평 방향으로 장착된 성인 시신경엽의 이미지입니다.뇌를 옆으로 90도 뒤집어 수평으로 위치시키면 시신경엽의 모든 신경필과 피질이 단일 평면에서 볼 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 프로토콜 전반에 걸쳐 뇌 조직을 용액에 담그는 상태로 유지하는 것입니다. 뇌가 공기에 노출되면 얼룩의 품질과 최종 이미지가 크게 저하됩니다.장착 방향이 시신경 엽 시각화에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 실시간 이미징에 중요합니다. 유충 및 성충 뇌는 세포 분열 또는 자신의 형태 변화를 추적하기 위해 며칠에 걸쳐 배양하고 이미지화할 수 있습니다. 여기서 장착 방향이 매우 중요한데, 관심 세포 유형이 in vivo 형광 신호의 최적 검출을 위해 cover slip에 가까워야 하기 때문입니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

연구

발생학

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...