Name: dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Claude Desplan for å dele med oss en alikvot av Bsh-antistoffet. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up og Bruchpilot monoklonale antistoffer ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, opprettet av NICHD ved NIH og vedlikeholdt ved University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA 52242. Dette arbeidet ble støttet av et NSERC Discovery Grant tildelt T.E. UA støttes av et NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship. PV støttes av et Ontario Graduate Scholarship.

1. Forberede larvehjerner for konfokal avbildning
<ol><li>Disseksjoner NOTAT: Før du starter disseksjonen, må du klargjøre løsningen (4 % formaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS)) og PBT (0,1-0,3 % Triton i PBS). Fiksløsningen skal legges på is under disseksjonen. Selv om paraformaldehyd (PFA) fikseringsmiddel brukes i denne protokollen, er alternative fikseringsstrategier (ved bruk av PLP20 eller PEM21) beskrevet for spesifikke epitoper. For la...

<ol>
	<li>Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure.">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell Tissue Research. 258, (1989).</li><li>Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+and+early+differentiation+of+the+optic+lobes+in+Drosophila+melanogaster.">Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).</li><li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Insect+and+Vertebrate+Visual+Systems.">Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems.</a> Neuron. 66, 15-36 (2010).</li><li>N&#233;riec, N., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Eye+to+the+Brain.+Development+of+the+Drosophila+Visual+System.">From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 247-271 (2016).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Challenge+of+Numbers+and+Diversity:+Neurogenesis+in+the+Drosophila+Optic+Lobe.">A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe.</a> Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).</li><li>Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+the+generation+of+neuronal+diversity:+Lessons+from+the+fly+visual+system.">Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140 (2019).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Role+of+the+Vsx+Genes+Supports+a+Monophyletic+Origin+for+Bilaterian+Visual+Systems.">Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems.</a> Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).</li><li>Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+evolution+at+high+resolution:+The+neuron+as+a+unit+of+homology.">Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology.</a> Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+projection+neurons+in+the+Drosophila+lobula+link+feature+detection+to+distinct+behavioral+programs.">Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+pattern+of+neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+visual+system:+A+user's+guide+to+the+dynamic+morphology+of+the+developing+optic+lobe.">Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe.</a> Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+Drosophila+medulla+neuroblasts+controls+neural+fates.">Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates.</a> Nature. 498, 456-462 (2013).</li><li>Erclik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+temporal+and+spatial+patterning+generates+neural+diversity.">Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity.</a> Nature. 541, 365-370 (2017).</li><li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+region-specific+neurogenesis+mode+requires+migratory+progenitors+in+the+Drosophila+visual+system.">A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system.</a> Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).</li><li>Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+mechanism+that+produces+neuronal+diversity+in+the+Drosophila+visual+center.">A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center.</a> Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).</li><li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe.">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li><li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless/Pax6.">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li><li>Millard, S. S., Pecot, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+assembling+columns+and+layers+in+the+Drosophila+visual+system.">Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system.</a> Neural Development. 13, 1-17 (2018).</li><li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe:+The+input+terminals+to+the+medulla.">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li><li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation.">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li><li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+drosophila+melanogaster.">Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51792 (2014).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, 4139-4147 (1996).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval,+pupal+and+adult+Drosophila+retinas.">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> Journal of visualized experiments. , e4347 (2012).</li><li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains.">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174 (2017).</li><li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936 (2010).</li><li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper.">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li><li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit.">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li><li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts.">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756 (2014).</li><li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers.">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410 (2017).</li><li>&#214;zel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

I denne protokollen beskriver vi en metode for å immunfarge larve- og voksne Drosophila-hjerner og montere dem i flere retninger. Mens metoder for å farge larver og voksne hjerner tidligere har blitt beskrevet 22,23,24,27,28, har monteringsstrategier for optimal visualisering av spesifikke optiske lappstrukturer fått mindre oppmerksomhet<sup class=...

Drosophila-synssystemet, som består av det sammensatte øyet og den underliggende synslappen, har vært en utmerket modell for studiet av nevrale kretsutvikling og funksjon. Spesielt de siste årene har synsloben dukket opp som et kraftig system for å studere nevroutviklingsprosesser som nevrogenese og kretsledninger 1,2,3,4,5,6,7,8. Den består av fire nevropiler: lamina, medulla, lobula og lobulaplate (de to sistnevnte utgjør lobula-komplekset)1,2,3,4,5,6. Fotoreseptorer fra øyet retter seg mot nevroner i lamina og medulla, som behandler visuelle innganger og videresender dem til nevropillene i lobula-komplekset 1,2,3,4,5,6. Projeksjonsnevroner i lobula-komplekset sender deretter visuell informasjon til de høyere ordens prosesseringssentrene i den sentrale hjernen 1,5,9. Den komplekse organiseringen av den optiske, nødvendiggjort av et behov for å opprettholde retinotopi og å behandle forskjellige typer visuelle stimuli, gjør den til et attraktivt system for å studere hvordan sofistikerte nevrale kretser er satt sammen. Spesielt deler medulla slående likheter i både organisering og utvikling med nevronetthinnen, som lenge har vært en modell for utvikling av virveldyrs nevrale kretsløp 3,8.
Utviklingen av en optisk begynner under embryogenese, med spesifikasjonen av ~35 ektodermale celler som danner den optiske plakoden 2,4,5,6,7,8. Etter larveklekking er den optiske plakoden delt inn i to distinkte primordia: 1) det ytre proliferasjonssenteret (OPC), som genererer nevronene i lamina og ytre medulla og 2) det indre proliferasjonssenteret (IPC), som genererer nevroner i det indre medulla og lobula-komplekset 4,5,6,10 . I den sene andrestjernelarven begynner nevroepitelcellene i OPC og IPC å transformere seg til nevroblaster som deretter genererer nevroner via mellomliggende gangliemorceller 4,5,11,12. Nevroblaster i optiske er mønstret av romlig og tidsmessig begrensede transkripsjonsfaktorer, som virker sammen for å generere nevralt mangfold i deres avkom 11,12,13,14. I puppen er kretsene til de optiske nevropilene satt sammen via koordinering av flere prosesser, inkludert programmert celledød11,15, nevronal migrasjon12,16, aksonal/dendrittisk målretting10,17, synapsedannelse18,19 og nevropilrotasjoner 10,17.
Her beskriver vi metodikken som larver og voksne hjerner dissekeres, immunfarges og monteres for avbildning av synslappen. Gitt den komplekse tredimensjonale organiseringen, krever analyse av synsloben at man forstår hvordan dens voksne nevropiller og larveforfedre er plassert i forhold til hverandre og den sentrale hjernen. Derfor legger vi spesiell vekt på hvordan orienteringen av monteringen forholder seg til den romlige organiseringen av de optiske lobestrukturene. Vi beskriver tre monteringsstrategier for larvehjerner (fremre, bakre og laterale) og tre for voksne hjerner (fremre, bakre og horisontale), som hver gir en optimal vinkel for avbildning av en spesifikk optikallappstampopulasjon eller nevropil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1077px;" width="1077">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">10x PBS</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">PBS405</td>
			<td style="width:357px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">37% formaldehyde</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">FOR201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 488 (goat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11055</td>
			<td>use at 1:501</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 555 (mouse) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-31570</td>
			<td>use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21450</td>
			<td>use at 1:503</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Alexa Fluor 647 (rat) secondary</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-21247</td>
			<td>use at 1:502</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Cover slips</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #5</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissecting forceps - #55</td>
			<td style="width:325px;">Dumont</td>
			<td style="width:164px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dissection Dish</td>
			<td style="width:325px;">Corning</td>
			<td>722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Dry wipes</td>
			<td style="width:325px;">Kimbery Clark</td>
			<td style="width:164px;">34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Goat anti-Bgal primary antibody</td>
			<td>Biogenesis</td>
			<td></td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Bsh primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Gift from Claude Desplan</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Erclik et al. 2008</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:357px;">use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:325px;">Parfilm</td>
			<td style="width:164px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:325px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:164px;">72.706.600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:325px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">CA4823-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-dac primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:164px;">mabdac2-3</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-eya primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">eya10H6</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-nc82 primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">nc82</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Mouse anti-svp primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">Seven-up 2D3</td>
			<td>use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Polymer Clay</td>
			<td>Any type of clay can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">A-11122</td>
			<td>use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Rat anti-DE-Cadherin primary antibody</td>
			<td style="width:325px;">DSHB</td>
			<td style="width:164px;">DCAD2</td>
			<td>use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Slowfade mounting medium</td>
			<td style="width:325px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:164px;">S36967</td>
			<td>Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:231px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:325px;">Bioshop</td>
			<td style="width:164px;">TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization

Drosophila-optikallappen, som består av fire nevropiler: lamina, medulla, lobula og lobulaplate, er et utmerket modellsystem for å utforske utviklingsmekanismene som genererer nevralt mangfold og drivkretsmontering. Gitt den komplekse tredimensjonale organiseringen, krever analyse av synsloben at man forstår hvordan dens voksne nevropiller og larveforfedre er plassert i forhold til hverandre og den sentrale hjernen. Her beskriver vi en protokoll for disseksjon, immunfarging og montering av larve- og voksenhjerner for synsavbildning. Det legges spesiell vekt på forholdet mellom monteringsorientering og den romlige organiseringen av den optiske loben. Vi beskriver tre monteringsstrategier i larven (fremre, bakre og laterale) og tre hos den voksne (fremre, bakre og horisontale), som hver gir en ideell avbildningsvinkel for en distinkt synslappstruktur.

Konfokale bilder av larver og voksne optikklapper montert i orienteringene beskrevet i protokollen er presentert i figur 1 og figur 2.
Figur 1 viser skjemaer og representative konfokale skiver av larvehjerner plassert i fremre, bakre og laterale orienteringer. I den fremre monteringsretningen vises OPC-epitelet (DE-Cadherin), medulla-nevroblaster (deadpan>βgal) og lamina-nevroner (dachshund) på...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization at JoVE.com

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Denne protokollen beskriver tre trinn for å forberede larver og voksne Drosophila optiske for avbildning: 1) hjernedisseksjoner, 2) immunhistokjemi og 3) montering. Det legges vekt på trinn 3, da det kreves distinkte monteringsorienteringer for å visualisere spesifikke optiske lobestrukturer.

Disseksjon, immunhistokjemi og montering av larve- og voksne Drosophila-hjerner for visualisering av optisk

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Vi beskriver en protokoll for å dissekere, immunfarge og montere larve- og voksne Drosophila-hjerner med spesiell vekt på synslappene. Gitt optikallappens komplekse tredimensjonale organisasjon, forventes det at protokollen beskrevet her vil gi forskere en større forståelse av forholdet mellom monteringsorientering og de visualiserte optiske lobstrukturene. Denne protokollen beskriver tre monteringsstrategier for både larve- og voksne optikklapper, som hver gir en optimal vinkel for å visualisere en spesifikk optisk lappstruktur under avbildning.Før du begynner disseksjonen, fyll alle brønnene i en trebrønnsplate med 400 mikroliter PBS per brønn, og bruk tang til å forsiktig velge 15 vandrende tredje instar-larver som kryper på innsiden av et drosophila-hetteglass eller flaske. Plasser alle larvene i den første brønnen av trebrønnsplaten, og overfør en larve til den midterste brønnen på platen. Bruk den ikke-dominerende hånden, hold larvens kropp ved bunnen av brønnen og bruk den dominerende hånden til å ta forsiktig tak i larvens munnkrok.Trekk munkroken vekk fra kroppen for å fjerne hjernen. Fjern deretter tilbehørsvevet, inkludert de imaginære platene. Plasser deretter hjernen i den tredje brønnen på platen.Når alle hjerner er dissekert, bruk en P200-pipette for å forsiktig fjerne PBS fra den tredje brønnen, og etterlate akkurat nok løsning til å holde hjernen nedsenket. Tilsett 500 mikroliter nylaget kaldfikseringsløsning i brønnen. Rør løsningen forsiktig med tangen slik at hjernen virvler i fatet, og dekk brønnen med et glassmikroskopglass.Legg deretter fatet på is i 30 minutter for å fikse vevet. Vask hjernen fem ganger med 400 mikroliter fersk PBS pluss triton per vask. Hjernene er nå klare for primær antistoffinkubasjon.For voksne hjernedisseksjoner, bedøve 10 til 15 voksne fluer og legg dem på en laboratorietørke over is. Bruk tang til å forsiktig overføre en voksen flue ved vingen til en brønn på en disseksjonsplate med tre brønner som inneholder 400 mikroliter PBS. Bruk en tang i den ikke-dominante hånden for å holde brystkassen på flua mot bunnen av brønnen, og bruk ultrafin tang med den dominante hånden for å trekke hodet forsiktig fra resten av kroppen.Kast kroppen på en laboratorieserviett med den ikke-dominerende hånden og bruk den dominerende hånden til å holde hodet mot bunnen av brønnen ved snabelen. Bruk begge tangene til å skrelle bort hvert område av neglebåndet mellom øynene, til hjernen er eksponert, og fjern eventuelt tilbehørsvev som forblir festet til hjernen. Plasser den rensede hjernen i den tredje brønnen og disseker neste hjerne som demonstrert, til 15 hjerner er oppnådd, eller en maksimal disseksjonsperiode på 30 minutter har gått.Fest hjernen med 500 mikroliter fikseringsløsning i 20 minutter ved romtemperatur, og vask hjernen fem ganger med PBS pluss triton, som demonstrert. Voksne hjerner er nå klare for primær antistoffinkubasjon. Bytt ut den siste vasken med to dråper fluorescerende sikkert monteringsmedium for å senke hjernen, og legg til en enkelt dråpe monteringsmedium i midten av et nytt glassmikroskopobjektglass.Bruk tang for å ta tak i hver larvehjerne ved den ventrale nervestrengen for overføring til objektglasset. For å visualisere forfedre og nevroner fra den sentrale regionen av det ytre spredningssenteret, Lamina eller lobulapluggen, sørg for at den ventrale nervestrengen stikker ut over, plasser larvehjernene på objektglasset med den fremre siden av vevet vendt opp. For å visualisere celler som tilhører spissene av de ytre eller indre spredningssentrene, sørg for at den ventrale nervestrengen stikker ut under.Plasser larvehjernen på objektglasset med den bakre siden av vevet vendt opp. For å visualisere halvmånen av nevroner fra de indre og ytre spredningssentrene i både den dorsale ventrale og mediale laterale aksen, bruk en skarp tang eller en wolframnål for å dele hjernelappene ned gjennom den ventrale nervestrengen, med start fra spaltningspunktet mellom. Vend hver på nytt med sidesiden vendt opp.Når larvehjernen har blitt riktig orientert, plasser en liten dråpe monteringsmedier på hver side av hjernen. Plasser en dekkglass på hver dråpe, og legg en siste dekkglass over hjernen slik at høyre og venstre kant hviler på de to andre dekkglassene, og danner en dekkbro. Bruk deretter neglelakk for å forsegle kantene på dekselbroen for å feste de monterte hjernene.Etter den siste sekundære antistoffvasken, utfør en siste vask med 400 mikroliter PBS. Bytt ut PBS med tre dråper fluorescerende sikkert monteringsmedium for å senke hjernen. Legg til en dråpe monteringsmedier på venstre og høyre tredjedel av et glassmikroskopobjektglass.Plasser en dekkglass over hver dråpe for å bygge en dekkbro. Forsegl ytterkantene på høyre dekkglass med neglelakk og legg en enkelt dråpe monteringsmiddel mellom dekselglassene. Bruk tang til å overføre hjernen forsiktig til objektglasset med ekstra forsiktighet for å unngå å skade synslappene.For å visualisere cellelegemene til lamina- og medulla-nevronene, bruk en wolframnål for å orientere hjernen i en fremre posisjon med antennelobene som stikker utover. For å visualisere nevroner i lobula-komplekset, orienter hjernen i en bakre med antennelappene vendt ned mot glideposisjonen. For å visualisere alle optiske lappnevropiler i et enkelt plan, orienter hjernen i horisontal stilling, still opp hjernen i et fremre feste, og bruk deretter en wolframnål til å rotere hver hjerne 90 grader oppover slik at den sitter på sin ventrale side og hviler på kanten av dekkglasset.Når de voksne hjernene har blitt riktig orientert, plasser en siste dekkglass over hjernen slik at høyre og venstre kant overlapper med de to andre dekkglassene for å danne en bro, forsegl objektglasset med neglelakk. Her er et bilde av en larveoptisk i fremre monteringsretning. I den fremre monteringsorienteringen vises epitelet til det sentrale høyere spredningssenteret, medulla nevroblast og lamina-nevroner på overflaten som bånd av celler som vikler seg rundt hjernen.Dypere inn i hjernen, i midten av Z-stabelen, er det viktigste ytre spredningssenterepitelet og dets respektive nevroblast og nevroner synlige. I tillegg er epitelet til det indre proliferasjonssenteret og nevronene i lobulapluggen synlige i disse mellomskivene. De dypeste Z-skivene viser den andre siden av hjernen der de bakre spissene av det ytre spredningssenteret er plassert.Den overfladiske spissen av det indre spredningssenteret er også til stede. Merk at dette ville være de første strukturene som var synlige hvis den optiske loben ble montert bakover. Her er et bilde fra en optisk montert på siden.På overflaten av sidefestet er laminahalvmånen synlig og lobulaplugghalvmånen er plassert mellom armene. Medulla nevronal halvmåne vises i en litt dypere Z-posisjon. Her er et bilde av en voksen optisk montert i en fremre retning.Siden medulla er plassert på overflaten av det fremre festet, er medulla cortex umiddelbart synlig. Cellelegemer i cortex projiserer sine arboriseringer inn i nevropilen, som kan visualiseres i en mellomliggende Z-posisjon. Lobula vises også på dette nivået, orientert vinkelrett på medulla.I den dypeste Z-posisjonen, den siste nevropilen til synslappen, er lobulaplaten synlig. Merk at lobulaplaten vil være den første strukturen som er synlig i et bakre feste. Her er et bilde av en voksen optisk montert i horisontal retning.Når hjernen er snudd 90 grader på siden til en horisontal stilling, er alle nevropillene og cortices i synslappen synlige i et enkelt plan. Når du utfører denne protokollen, er det viktigste å huske å holde hjernevevet nedsenket i løsning gjennom hele protokollen. Hvis hjernen utsettes for luft, vil kvaliteten på flekken og derfor de endelige bildene bli betydelig redusert.En forståelse av hvordan monteringsorientering påvirker visualisering av optiske lober er viktig for levende bildebehandling. Larve- og voksne hjerner kan dyrkes og avbildes over flere dager for å følge celledelinger eller endringer i din egen morfologi. Her er monteringsretningen kritisk, da celletypene av interesse må være nær dekselglasset for optimal deteksjon av det fluorescerende signalet in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Disseksjon av Larve Sebrafisk Gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Disseksjon og flekker av Drosophila Pupal eggstokkene

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisering og analyse av farynle arterier ved hjelp av hele mount immunohistokjemi og 3D rekonstruksjon

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Utarbeidelse av Drosophila Larval og Pupal Testiklene for analyse av celledivisjon i Live, intakt vev

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

En protokoll for immunhiistokjemi og RNA in-situ distribusjon innen tidlig Drosophila embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Disseksjon og live-imaging av sen embryonal drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Stikksårskademodell av voksenoptisk tektum ved bruk av sebrafisk og medaka for komparativ analyse av regenerativ kapasitet

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...