Name: phage therapy application to counteract pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis zebrafish embryos
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

I pesci zebra adulti (Danio rerio) del ceppo AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) sono mantenuti secondo le linee guida internazionali (Direttiva UE 2010/63/UE) e nazionali (decreto italiano 4marzo 2014, n. 26) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Le condizioni standard sono fissate nell'impianto ittico con un ciclo di buio di 14 ore /10 h e una temperatura dell'acqua del serbatoio a 28 °C.
1. Preparazione di soluzioni e strumenti
<ol><li...

<ol>
	<li>Cisek, A. A., D&#261;browska, I., Gregorczyk, K. P., Wy&#380;ewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment:+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages.">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li><li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+phage+therapy+in+cystic+fibrosis:+Essential+human-bacterial-phage+interactions+and+delivery+considerations+for+use+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+airways.">The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).</li><li>Pacios, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+combat+multidrug-resistant+and+persistent+infectious+diseases.">Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases.</a> Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).</li><li>Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplication+of+bacteriophage+in+vivo+and+its+protective+effect+against+an+experimental+infection+with+shigella+dysenteriae.">The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae.</a> Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).</li><li>Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+therapeutically+administered+bacteriophages+in+Pseudomonas+aeruginosa+infected+patients.">Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients.</a> Burns. 32 (5), 644-656 (2006).</li><li>Heo, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+efficacy+of+phages+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+mice+and+Drosophila+melanogaster.">Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).</li><li>McVay, C. S., Vel&#225;squez, M., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+a+mouse+burn+wound+model.">Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).</li><li>Forti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+broad-range+bacteriophage+cocktail+that+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+treats+acute+infections+in+two+animal+models.">Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).</li><li>Jault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+tolerability+of+a+cocktail+of+bacteriophages+to+treat+burn+wounds+infected+by+Pseudomonas+aeruginosa+(PhagoBurn):+a+randomised,+controlled,+double-blind+phase+1/2+trial.">Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial.</a> Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).</li><li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).</li><li>Clatworthy, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+of+zebrafish+involves+both+host+and+pathogen+determinants.">Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants.</a> Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).</li><li>Bernut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+Protects+against+Mycobacterium+abscessus+Infection+by+Fine-Tuning+Host+Oxidative+Defenses.">CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses.</a> Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).</li><li>Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosol+phage+therapy+efficacy+in+Burkholderia+cepacia+complex+respiratory+infections.">Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Doring, G., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+innate+immunity:+how+chloride+channel+mutations+provoke+lung+disease.">Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease.</a> Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).</li><li>Navis, A., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cftr+function+leads+to+pancreatic+destruction+in+larval+zebrafish.">Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish.</a> Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).</li><li>Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cftr+controls+lumen+expansion+and+function+of+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 140, 1703-1712 (2013).</li><li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns.">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979 (2015).</li><li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model.">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527 (2019).</li><li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction.">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System.">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li></ol>

In questo manoscritto, abbiamo descritto il protocollo per eseguire l'infezione da P. aeruginosa (PAO1) negli embrioni di zebrafish e come applicare la terapia del fago con un cocktail di fagi precedentemente identificati come in grado di infettare PAO1 per risolverlo. L'uso di batteriofagi come alternativa ai trattamenti antibiotici è stato di crescente interesse dagli ultimi anni. Ciò è dovuto principalmente alla diffusione di infezioni batteriche multi-resistenti ai farmaci (MDR), che costituiscono un grav...

La terapia del fago, l'uso dei nemici naturali dei batteri per combattere le infezioni batteriche, sta raccogliendo rinnovato interesse man mano che la resistenza batterica agli antibiotici diventadiffusa 1,,2. Questa terapia, utilizzata da decenni nell'Europa orientale, potrebbe essere considerata un trattamento complementare agli antibiotici nella cura delle infezioni polmonari nei pazienti con CF e una possibile alternativa terapeutica per i pazienti infetti da batteri resistenti a tutti gli antibiotici attualmente in uso2,,3. I vantaggi della terapia antibiotica sono che i batteriofagi si moltiplicano nel sito di infezione, mentre gli antibiotici vengono metabolizzati ed eliminati dalcorpo 4,5. In effetti, la somministrazione di cocktail di fagi virulenti isolati in diversi laboratori si è dimostrata efficace nel trattare le infezioni da Pseudomonas aeruginosa in modelli animali diversi come insetti e mammiferi6,,7,,8. La terapia del fago ha anche dimostrato di essere in grado di ridurre il carico batterico nelle ferite da ustione infettate da P. aeruginosa ed Escherichia coli in uno studio clinico randomizzato9.
Zebrafish (Danio rerio) è recentemente emerso come un modello prezioso per studiare le infezioni con diversi agenti patogeni, tra cui P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,,13. Microiniettando batteri direttamente nella circolazione sanguignadell'embrione 14 è facile stabilire un'infezione sistemica che viene contrastata dal sistema immunitario innato zebrafish, che è evolutivo conservato con neutrofili e generazione di macrofagi simile alla controparte umana. Inoltre, durante il primo mese di vita, gli embrioni di zebrafish mancano della risposta immunitaria adattiva, rendendoli modelli ideali per studiare l'immunità innata, che è il meccanismo di difesa critico nelle infezioni polmonariumane 15. Zebrafish è recentemente emerso come un potente sistema di modelli genetici per comprendere meglio l'insorgenza della CF e sviluppare nuovi trattamentifarmacologici 10,,16,,17. Il modello cf zebrafish di cftr knock-down generato con iniezione di morfolino nel pesce zebra ha presentato una risposta di scoppio respiratorio smorzato e una ridotta migrazione neutrofila10, mentre il knock-out cftr porta a una posizione interna dell'organo compromessa e alla distruzione del pancreas esocrina, un fenotipo che rispecchia la malattia umana16,,17. Di maggiore interesse è stato il risultato che il carico batterico P. aeruginosa è stato significativamente più elevato negli embrioni cftr-perdita di funzione che nei controlli a 8 ore dopo l'infezione (hpi), che è parallelo ai risultati ottenuti con topi e cellule epiteliali bronchialiumane 2,18.
In questo lavoro, dimostriamo che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa negli embrioni di zebrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:108px;">214010</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s phospate buffered saline PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>common name tricaine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Femtojet Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fleming/brown P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LE-Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685660001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low Melting Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microinjection needles</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Phenylthiourea &#62;=98%</td>
			<td>Aldrich-P7629</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oligo Morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>designed by the researcher</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG6000</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenol Red Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 143-74-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-06-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Z-MOLDS Microinjection</td>
			<td>Word Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage therapy application to counteract pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis zebrafish embryos

La resistenza antimicrobica, una delle principali conseguenze dell'incertezza diagnostica e della sovraprescrizione antimicrobica, è una causa sempre più riconosciuta di infezioni gravi, complicazioni e mortalità in tutto il mondo con un enorme impatto sulla nostra società e sul sistema sanitario. In particolare, i pazienti con sistema immunitario compromesso o patologie preesistenze e croniche, come la fibrosi cistica (CF), sono sottoposti a frequenti trattamenti antibiotici per controllare le infezioni con l'aspetto e la diffusione di isolati multifarmacologici resistenti. Pertanto, vi è l'urgente necessità di affrontare terapie alternative per contrastare le infezioni batteriche. L'uso di batteriofagi, i nemici naturali dei batteri, può essere una possibile soluzione. Il protocollo dettagliato in questo lavoro descrive l'applicazione della terapia del fago contro l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish CF. Gli embrioni di zebrafish sono stati infettati da P. aeruginosa per dimostrare che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa in quanto riduce la letalità, il peso batterico e la risposta immunitaria pro-infiammatoria negli embrioni CF.

I risultati e le cifre qui presentati sono riferiti agli embrioni di CF generati attraverso l'iniezione di cftr morpholinos come descritto inprecedenza 10 e nella fase 5. Per convalidare il fenotipo CF, è stata presa in considerazione la posizione compromessa di organi interni come cuore, fegato e pancreas come descritto in precedenza17 (Figura 1). Risultati analoghi sono stati ottenuti nel caso degli embrioni WT, come riportato nella...

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Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Presentato qui è un protocollo per l'infezione da Pseudomonas aeruginosa e l'applicazione della terapia del fago negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (CF).

Applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Questo protocollo facilita la preparazione e la somministrazione di un cocktail virale e fago contro pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in vivo dell'efficacia del fago nel contrastare l'infezione batterica. Il cocktail di fago è efficiente sia nei modelli zebrafish di tipo selvatico che cystic fibrosi.Apertura della possibilità di applicare la terapia del fago alle infezioni batteriche nei pazienti con fibrosi cistica. La terapia del fago può anche essere applicata per contrastare specifiche infezioni batteriche in altri sistemi modello. Per preparare un fago per l'esperimento.Aggiungere 1,25 per 10 al settimo fagi a un OD 600 della cultura di 0,05 P.aeruginosa a una molteplicità di infezione da uno per 10 a tre negativi e incubare la coltura per tre o quattro ore con tremori fino a quando l'OD 600 scende a 0,1 a 0,3. Al termine dell'incubazione incubare il lisato con un microgrammo per millilitro di DNAsi e RNAsi per 30 minuti a 37 gradi Celsius. E pellettò le cellule per centrifugazione.Al termine del filtro di centrifugazione il supernatante attraverso un diametro del poro di 0,8 micrometri e aggiungere 58 grammi per litro di cloruro di sodio e 105 grammi per litro di PEG 6000. Incubare la soluzione a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, precipitare il fago per centrifugazione.Al termine della centrifugazione rimuovere il supernatante e sciogliere con cura il pellet di fago in 15 millilitri di tampone di cloruro di sodio Tris. Per purificare i fagi mediante gradiente di densità del cloruro di cesio, prima stratificare due millilitri di quattro diverse soluzioni di cloruro di cesio in tubi di poliallomero ultracentrifugo per un rotore SW 41 e aggiungere 3,5 millilitri della sospensione del fago a ciascun tubo. Il cloruro di cesio è tossico.Adottare sempre procedure di sicurezza adeguate durante la manipolazione e lo scarto di questo composto. Una volta caricati tutti i tubi, posizionare i tubi nel rotore facendo attenzione che i tubi siano bilanciati. E centrifugare i campioni per due ore a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius.Al termine della centrifugazione, utilizzare una siringa con un ago calibro 19 per aspirare lo strato bianco tra la D uguale a 1,5 e la D è uguale a 1,4 regioni di densità. E trasferire le sospensioni in nuovi tubi in poliallomero sw 60. Centrifugare le sospensioni per almeno 16 ore a 150.000 volte g e quattro gradi Celsius.E trasferire le bande visibili in tubi di dialisi con un taglio di 6.000 Dalton. Quindi dializzare i campioni raccolti due volte contro 500 millilitri di acqua per 20 minuti per dialisi e durante la notte contro 500 millilitri di tampone di cloruro di sodio Tris. La mattina seguente, filtrare il materiale fago risultante con un filtro poro di 0,22 micro metri e conservare il magazzino a quattro gradi Celsius.Il giorno della micro iniezione diluire due soluzioni di morpholinos micromolare in acqua sterile ad una concentrazione finale di 0,25 picomolare per embrione per ottenere una soluzione di iniezione di morfolino a cinque microliter. E aggiungere 0,5 microlitri di rosso fenolo ad ogni soluzione. Successivamente utilizzare una micropipetta da 20 microliter con una punta di caricamento in gel fine per caricare un micro ago di iniezione con l'intero volume di soluzione mista di morfolino e fissare l'ago a un micro manipolatore collegato a un supporto al microscopio stereo.Quindi, con una o due cellule, embrioni di pesce zebra disposti su uno scivolo di vetro posto all'interno di una piastra di Petri di 96 millimetri di diametro, penetrano nel corore e nel tuorlo con la punta dell'ago a micro iniezione e iniettano due nanolitri della miscela di morfina nell'embrione. A 26 ore dalla fecondazione, caricare un micro ago di iniezione con circa cinque microlitri di P.aeruginosa inoculum e inserire l'ago dorsalmente al punto di partenza del condotto di Cuvier in cui il condotto inizia a diffondersi sul sacco del tuorlo. Iniettare uno o tre nanolitri dell'inoculo PAO1 nell'embrione assicurandosi che il volume si espanda direttamente all'interno del condotto ed entri nella circolazione.Dopo l'iniezione trasferire l'embrione in una delle due nuove piastre di Petri contenenti mezzo fresco E3 integrato con feniltiourea per un'incubazione di 30 minuti o tre ore a 28 gradi Celsius. Successivamente, caricare un micro ago di iniezione con circa cinque microlitri del cocktail di fago e fissare l'ago al micro iniettore. Quindi iniettare da uno a tre nanolitri di cocktail di fago nel condotto di Cuvier di ogni embrione precedentemente iniettato con batteri e posizionare gli embrioni in una delle due nuove piastre di Petri contenenti mezzo fresco E3 integrato con feniltiourea a 28 gradi Celsius.A quattro ore dalla post-infezione, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire un embrione anestetizzato in un piatto di fondo di vetro. E riempire il piatto con una soluzione calda di agarosio a basso punto di fusione. Quando l'agarosio è freddo, riempire delicatamente il piatto con mezzo E3 integrato con soluzione anestetica.Posizionare il piatto al microscopio stereo e utilizzare una punta di pipetta per posizionare l'embrione nell'orientamento desiderato. Quindi posizionare il piatto sotto un microscopio stereo fluorescente con un filtro fluorescente per batteri positivi alla GFP per un massimo di 18 ore dopo l'infezione e l'immagine dell'embrione per la progressione dell'espressione della GFP a nove, 14 e 18 ore dopo l'infezione. Per determinare il carico batterico a otto ore dopo l'infezione, trasferire 15 embrioni microiniettati anesteti in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e sostituire la soluzione anestetica con 300 microlitri dell'1%Triton X-100 in PBS.Passare gli aghi attraverso l'ago sterile calibro 27 di una siringa per insulina almeno 15 volte per omogeneizzare gli embrioni. E preparare le diluizioni seriali dell'omogeneato trasferendo 100 microlitri della miscela risultante in 900 microlitri di PBS sterile per diluizione. Per selezionare il ceppo P.aeruginosa naturalmente resistente all'ampicillina, placcare 10 microlitri delle diluizioni sull'agar LB integrato con ampicillina e incubarli durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo conta il numero di colonie. Per consentire il calcolo del numero totale di unità di formazione della colonia e del numero medio di unità di formazione della colonia per embrione infetto. Per valutare la letalità dell'infezione da P.aeruginosa segnare gli embrioni iniettati a 20 ore dopo l'infezione al microscopio stereo contando il numero di embrioni bianchi opachi morti.Quindi calcolare la mezza concentrazione letale massima 50 dose di P.aeruginosa che ha portato alla morte del 50% degli embrioni iniettati a 20 ore dopo l'infezione. Per convalidare il fenotipo della fibrosi cistica è possibile valutare la posizione compromessa degli organi interni come il fegato cardiaco e il pancreas. Il carico batterico è ridotto dalla terapia del fago negli embrioni di fibrosi cistica infettati da P.Aeruginosa.In 48 ore dopo la fecondazione gli embrioni di fibrosi cistica infettati da batteri P.Aeroginosa positivi alla GFP, una colonia di 30 unità formatrici per dose embrionale dimostra una letalità del 50% a 20 ore dopo l'infezione. La terapia del fago è altrettanto efficace a 20 ore dopo l'infezione quando viene consegnata 30 minuti o sette ore dopo l'iniezione batterica. Qui, viene mostrata una fibrosi cistica e un embrione positivo alla GFP P.Aeruginosa iniettato a quattro, nove, 14 e 18 ore dopo l'infezione.Al contrario, la fibrosi cistica più P.Aeruginosa più l'embrione iniettato di fago dimostra una ridotta fluorescenza dovuta all'azione del fago contro i batteri. La risposta infiammatoria generata dall'infezione da P.aeruginosa negli embrioni di fibrosi cistica è significativamente aumentata come rivelato dall'espressione delle citochine pro-infiammatorie, TNF alfa e interleuchina 1 beta a seguito dell'iniezione di P.aeruginosa rispetto al controllo del pesce zebra iniettato. Tuttavia, l'espressione di entrambe le citochine infiammatorie è ridotta negli animali co-iniettati di cocktail di fago.I fagi devono essere accuratamente purificati per rimuovere eventuali endotossine contaminanti che possono essere trattenute durante il preparato. I preparati del fago possono essere analizzati mediante microscopia elettronica per valutare la morfologia del virione. Sarebbe interessante verificare se l'infezione nei pazienti umani da parte di batteri diversi dalle pseudomonas aeruginosa può essere curata con la terapia del fago nel modello del pesce zebra della fibrosi cistica.

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