Name: phage therapy application to counteract pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis zebrafish embryos
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Italiana de Fibrosis Quística (FFC-22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo y FFC-23/2019; Un respiro en piá Onlus La Mano tesa Onlus).

El pez cebra adulto (Danio rerio) de la cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) se mantiene de acuerdo con las directrices internacionales (Directiva 2010/63/UE de la UE) y nacionales (decreto italiano 4 de marzode 2014, n. 26) sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Las condiciones estándar se establecen en la instalación de peces con un ciclo oscuro de 14 h de luz/10 h y una temperatura del agua del tanque a 28oC.
1. Preparación ...

<ol>
	<li>Cisek, A. A., D&#261;browska, I., Gregorczyk, K. P., Wy&#380;ewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment:+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages.">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li><li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. 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En este manuscrito, describimos el protocolo para realizar la infección por P. aeruginosa (PAO1) en embriones de pez cebra y cómo aplicar la terapia de fagos con un cóctel de fagos previamente identificados como capaces de infectar PAO1 para resolverlo. El uso de bacteriófagos como alternativa a los tratamientos antibiótico ha sido de creciente interés desde los últimos años. Esto se debe principalmente a la difusión de infecciones bacterianas multirresistentes (MDR), que constituyen un problema grave p...

La terapia de fagos, el uso de los enemigos naturales de las bacterias para combatir las infecciones bacterianas, está acayendo un renovado interés a medida que la resistencia bacteriana a los antibióticos se generaliza1,,2. Esta terapia, utilizada durante décadas en Europa del Este, podría considerarse un tratamiento complementario a los antibióticos en el curado de infecciones pulmonares en pacientes con FQ y una posible alternativa terapéutica para pacientes infectados con bacterias que son resistentes a todos los antibióticos actualmente en uso2,,3. Las ventajas de la terapia antibiótica son que los bacteriófagos se multiplican en el lugar de la infección, mientras que los antibióticos se metabolizan y eliminan del cuerpo4,,5. De hecho, la administración de cócteles de fagos virulentos aislados en diferentes laboratorios ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en modelos animales tan diferentes como insectos y mamíferos6,,7,,8. La terapia de fagos también demostró ser capaz de reducir la carga bacteriana en las heridas por quemaduras infectadas con P. aeruginosa y Escherichia coli en un ensayo clínico aleatorizado9.
El pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un modelo valioso para estudiar infecciones con varios patógenos, incluyendo P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus y Burkolderia cepacia12,13. Mediante la microinyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea embrionaria14 es fácil establecer una infección sistémica que es contrarrestado por el sistema inmune innato de pez cebra, que es evolutivo conservado con neutrófilos y generación de macrófagos similar a la contraparte humana. Además, durante el primer mes de vida, los embriones de pez cebra carecen de la respuesta inmune adaptativa, lo que los convierte en modelos ideales para estudiar la inmunidad innata, que es el mecanismo crítico de defensa en las infecciones pulmonares humanas15. Zebrafish surgió recientemente como un potente sistema de modelos genéticos para comprender mejor el inicio del CF y desarrollar nuevos tratamientos farmacológicos10,,16,,17. El modelo de pez cebra CF de derribo de cftr generado con inyección de morfolino en peces cebra presentó una respuesta amortiguada de ráfaga respiratoria y una migración de neutrófilos reducida10,mientras que el knock-out del cftr conduce a una alteración de la posición interna del órgano y a la destrucción del páncreas exocrino, un fenotipo que refleja la enfermedad humana16,,17. De mayor interés fue la constatación de que la carga bacteriana de P. aeruginosa fue significativamente mayor en embriones cftr-pérdida de función que en controles a las 8 horas posteriores a la infección (hpi), que es paralela a los resultados obtenidos con ratones y células epiteliales bronquiales humanas2,18.
En este trabajo, demostramos que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa en embriones de pez cebra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:108px;">214010</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s phospate buffered saline PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>common name tricaine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Femtojet Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fleming/brown P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LE-Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685660001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low Melting Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microinjection needles</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Phenylthiourea &#62;=98%</td>
			<td>Aldrich-P7629</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oligo Morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>designed by the researcher</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG6000</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenol Red Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 143-74-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-06-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Z-MOLDS Microinjection</td>
			<td>Word Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage therapy application to counteract pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis zebrafish embryos

La resistencia a los antimicrobianos, una consecuencia importante de la incertidumbre diagnóstica y la sobrescripción antimicrobiana, es una causa cada vez más reconocida de infecciones graves, complicaciones y mortalidad en todo el mundo con un enorme impacto en nuestra sociedad y en el sistema de salud. En particular, los pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos o patologías preexistentes y crónicas, como la fibrosis quística (CF), son sometidos a frecuentes tratamientos antibiótico para controlar las infecciones con la aparición y difusión de aislados multirresistentes. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de abordar terapias alternativas para contrarrestar las infecciones bacterianas. El uso de bacteriófagos, los enemigos naturales de las bacterias, puede ser una posible solución. El protocolo detallado en este trabajo describe la aplicación de la terapia de fagos contra la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra CF. Los embriones de pez cebra se infectaron con P. aeruginosa para demostrar que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa, ya que reduce la letalidad, la carga bacteriana y la respuesta inmunitaria proinflamatoria en embriones CF.

Los resultados y las cifras aquí presentados se refieren a embriones CF generados a través de la inyección de cftr morpholinos como se describió anteriormente10 y en el paso 5. Para validar el fenotipo CF, se consideró la posición deteriorada de órganos internos como el corazón, el hígado y el páncreas como se describió anteriormente17 (Figura 1). Se obtuvieron resultados similares en el caso de los embriones WT, como se inf...

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Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Aquí se presenta un protocolo para la infección por Pseudomonas aeruginosa y la aplicación de terapia de fagos en embriones de peces cebra de fibrosis quística (CF).

Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Este protocolo facilita la preparación y administración de un cóctel viral y de fagos contra pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación in vivo de la eficacia del fago en la contracción de la infección bacteriana. El cóctel de fagos es eficiente tanto en modelos de peces cebra de tipo salvaje como de fibrosis quística.Abrir la posibilidad de aplicar la terapia de fagos a las infecciones bacterianas en pacientes con fibrosis quística. La terapia de phage también se puede aplicar para contrarrestar infecciones bacterianas específicas en otros sistemas modelo. Para preparar un caldo de fagos para el experimento.Añadir 1,25 veces 10 a los séptimos fagos a un OD 600 de 0,05 P.aeruginosa cultivo a una multiplicidad de infección de uno por 10 a los tres negativos e incubar el cultivo durante tres a cuatro horas con temblor hasta que el OD 600 cae a 0.1 a 0.3. Al final de la incubación de incubación el lisato con un microgramo por mililitro de DNAse y RNAse durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Y peletiza las células por centrifugación.Al final del filtro de centrifugación el sobrenadante a través de un diámetro de poro de 0,8 micro metros y añadir 58 gramos por litro de cloruro de sodio y 105 gramos por litro de PEG 6000. Incubar la solución a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, precipitar el fago por centrifugación.Al final de la centrofuga eliminar el sobrenadante y disolver cuidadosamente el pellet de fago en 15 mililitros de tampón de cloruro de sodio Tris. Para purificar los fagos por gradiente de densidad de cloruro de cesio, primero estratifiquen dos mililitros de cuatro soluciones diferentes de cloruro de cesio en tubos de ultracentrífuga de poliallomertro para un rotor SW 41 y agregue 3,5 mililitros de la suspensión del fago a cada tubo. El cloruro de cesio es tóxico.Adoptar siempre los procedimientos de seguridad adecuados al manipular y desechar este compuesto. Cuando se hayan cargado todos los tubos, coloque los tubos en el rotor teniendo cuidado de que los tubos estén equilibrados. Y centrifugar las muestras durante dos horas a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados.Al final de la centrifugación, utilice una jeringa con una aguja de calibre 19 para aspirar la capa blanca entre la D es igual a 1.5 y la D es igual a 1.4 regiones de densidad. Y transfiera las suspensiones a nuevos tubos de poliallomer tamaño SW 60. Centrifugar las suspensiones durante al menos 16 horas a 150.000 veces g y cuatro grados centígrados.Y transfiera las bandas visibles a tubos de diálisis con un límite de 6.000 Dalton. A continuación, dializar las muestras recogidas dos veces contra 500 mililitros de agua durante 20 minutos por diálisis y durante la noche contra 500 mililitros de tampón de cloruro de sodio Tris. A la mañana siguiente, filtre el material de fagos resultante con un filtro de poro de 0,22 micromestros y almacene el stock en cuatro grados centígrados.En el día de la micro inyección diluir dos soluciones de stock de morfolo morpholinos micromolar en agua estéril a una concentración final de 0,25 picomolar por embrión para obtener una solución de cinco microlitro morpho injectionlino. Y añadir 0,5 microlitros de fenol rojo a cada solución. A continuación, utilice una micropipeta de 20 microlitrotros con una punta de carga de gel fino para cargar una aguja de micro inyección con todo el volumen de solución mixta de morfolino y fije la aguja a un micro manipulador conectado a un soporte bajo un microscopio estereoreo.Luego, con una o dos células, embriones de peces cebra dispuestos en un portaobjetos de vidrio colocado dentro de una placa Petri de 96 milímetros de diámetro, penetrar la tarea y la yema con la punta de la aguja de inyección micro e inyectar dos nanolitros de la mezcla de morlino en el embrión. A las 26 horas después de la fertilización, cargue una aguja de micro inyección con aproximadamente cinco microlitros de P.aeruginosa inoculum e inserte la aguja dorsalmente hasta el punto de partida del conducto de Cuvier en el que el conducto comienza a extenderse sobre el saco de yema. Inyectar de uno a tres nanolitros del inóculo PAO1 en el embrión asegurándose de que el volumen se expande directamente dentro del conducto y entra en la circulación.Después de la inyección, transfiera el embrión a uno de los dos nuevos platos de Petri que contengan un medio E3 fresco complementado con fenitmiourea durante una incubación de 30 minutos o tres horas a 28 grados centígrados. A continuación, cargue una aguja de micro inyección con aproximadamente cinco microlitros del cóctel de fagos y fije la aguja al microinyector. A continuación, inyectar de uno a tres nanolitros de cóctel de fago en el conducto de Cuvier de cada embrión previamente inyectado con bacterias y colocar los embriones en uno de los dos nuevos platos de Petri que contienen un medio E3 fresco complementado con fenitmiourea a 28 grados Celsius.A las cuatro horas después de la infección, utilice una pipeta de plástico para transferir un embrión anestesiado a un plato de fondo de vidrio. Y llene el plato con una solución de agarosa caliente de punto de fusión bajo. Cuando la agarosa esté fría, llene suavemente el plato con E3 medio complementado con solución anestésica.Coloque el plato debajo del microscopio estéreo y utilice una punta de pipeta para colocar el embrión en la orientación deseada. A continuación, coloque el plato bajo un microscopio estéreo fluorescente con un filtro fluorescente para bacterias positivas de GFP durante un máximo de 18 horas después de la infección e imagine el embrión para la progresión de la expresión de GFP a las nueve, 14 y 18 horas después de la infección. Para determinar la carga bacteriana a las ocho horas posteriores a la infección, transfiera 15 embriones microinyecizados anestesiados a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y reemplace la solución anestésica por 300 microlitros de 1%Triton X-100 en PBS.Pase las agujas a través de la aguja estéril de calibre 27 de una jeringa de insulina al menos 15 veces para homogeneizar los embriones. Y preparar las diluciones en serie del homogeneato transfiriendo 100 microlitros de la mezcla resultante a 900 microlitros de PBS estériles por dilución. Para seleccionar la cepa P.aeruginosa resistente a la ampicilina natural, placa 10 microlitros de las diluciones sobre el agar LB complementado con ampicilina y incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente cuenta el número de colonias. Permitir el cálculo del número total de unidades formadoras de colonias y el número medio de unidades formadoras de colonias por embrión infectado. Para evaluar la letalidad de la puntuación de la infección por P.aeruginosa, los embriones inyectados a las 20 horas después de la infección bajo un microscopio estéreo contando el número de embriones blancos opacos muertos.A continuación, calcule la concentración letal media 50 dosis de P.aeruginosa que resultó en la muerte del 50% de los embriones inyectados a las 20 horas después de la infección. Para validar el fenotipo de fibrosis quística se puede evaluar la posición deteriorada de órganos internos como el hígado cardíaco y el páncreas. La carga bacteriana se reduce mediante la terapia de fagos en embriones de fibrosis quística infectados con P.Aeruginosa.En 48 horas después de la fertilización, los embriones de fibrosis quística infectados con la bacteria P.Aeroginosa positiva de la GFP, una 30 unidades formadoras de colonias por dosis embrionaria demuestra una letalalidad del 50% a las 20 horas posteriores a la infección. La terapia de phage es igualmente eficaz a las 20 horas después de la infección cuando se administra 30 minutos o siete horas después de la inyección bacteriana. Aquí, se muestra una fibrosis quística y un embrión inyectado por P.Aeruginosa positivo A.Aeruginosa a las cuatro, nueve, 14 y 18 horas después de la infección.Por el contrario, la fibrosis quística más P.Aeruginosa más el embrión inyectado de fago demuestra una fluorescencia reducida debido a la acción del fago contra las bacterias. La respuesta inflamatoria generada por la infección por P.aeruginosa en embriones de fibrosis quística aumenta significativamente según lo revelado por la expresión de las citoquinas proinflamatorias, TNF alfa e interleucina 1 beta después de la inyección de P.aeruginosa en comparación con el control del pez cebra inyectado. Sin embargo, la expresión de ambas citoquinas inflamatorias se reduce en los animales co-inyectados de colistos de fagos.Los fagos deben purificarse cuidadosamente para eliminar cualquier endotoxina contaminante que pueda conservarse durante la preparación. Las preparaciones de fagos se pueden analizar mediante microscopía electrónica para evaluar la morfología del virión. Sería interesante probar si la infección en pacientes humanos por bacterias distintas de pseudomonas aeruginosa se puede curar con terapia de fagos en el modelo de peces cebra de fibrosis quística.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

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Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Investigación

Inmunología e Infección

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

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El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

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Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

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Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

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Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

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Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

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Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...